本发明专利技术采用聚合酶链式反应（PCR）及分子信标荧光探针技术对B族链球菌中高保守特异性核酸序列进行扩增检测，从而判断B族链球菌的存在。提供了一种可替代的优化的检测B族链球菌的引物、短柄圆环探针序列、以及对应的试剂盒，对B族链球菌的PCR荧光法检测技术起到推动作用。样品检测最快可以在2-3小时内完成，具有检测速度快、检测成本低的特点。
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测B族链球菌特有序列的引物、探针及试剂盒
本专利技术涉及一种用于检测细菌的装置和方法，尤其涉及一种用于检测B族链球菌特有序列的引物、短柄圆环探针、以及试剂盒。
技术介绍
B族链球菌(GBS)学名为无乳链球菌(S.agalactiae)，是一种有荚膜的细菌，能够引起牛乳房炎，危害畜牧业非常严重，所以早为畜医界注目。后来发现该细菌能够感染人类，尤其是新生儿。该细菌所引起的败血病、脑膜炎、肺炎等疾病的死亡率极高，并且通常伴有神经系统后遗症，由此又被医学界所重视。B族链球菌感染也称作乙型链球菌感染，是新生儿败血症和脑膜炎、以及母亲感染的重要原因。1990年以来，美国由于分娩前采取预防性筛查，使早发的B族链球菌感染降低了 70%。根据分娩前得到筛查结果，患者可在住院后立即得到静脉注射抗生素治疗。目前，通常采用标准细菌培养方法来检测B族链球菌的存在，该方法从阴道和肛门取材，由于需要进行细菌培养，需要在35-37周孕期取材，大约需要18-48小时得到检测结果，比较费时，不能够有效、快速地检测出B族链球菌的存在。如果检测结果为阳性，需要给孕妇使用抗生素以预防她将细菌传染给婴儿。专利号为200410049736.4，名称为“用于检测B族链球菌特有序列的引物、短柄圆环探针、试剂盒及方法”的专利技术专利是一种用PCR扩增法检测B族链球菌的存在，该专利技术最快可以在2-3小时内完成，具有检测速度快、检测成本低的优点，但其引物和探针序列可以进一步改进、优化，以增进其检测的灵敏性、特异性、以及稳定性。
技术实现思路
因此，针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种替代现有技术的、优化的用于检测B族链球菌特有序列的引物、短柄圆环探针、以及试剂盒，以供实验室、临床研究使用，并能够应用于普查和预防工作，寻找可能的动物来源及从动物到人的转移与进化。本专利技术采用聚合酶链式反应(PCR)及分子信标荧光探针技术对B族链球菌中高保守特异性核酸序列进行扩增检测，从而判断B族链球菌的存在。为了实现上述目的，针对B族链球菌的特点，首先选择相应的靶序列，然后针对所选择的特定靶序列设计特异性的引物，特异性地扩增出目的DNA片段。因此，根据待测基因两端的DNA顺序的引物设定是本专利技术的要点。本专利技术提供了一种为进行PCR扩增B族链球菌选定的靶序列而设计的引物，其中该引物序列为:上游引物5 ’ -AGGAAGATTTATCGCACCTGAAAT-3 ’，即SEQ ID NO:1 ;下游引物5，- ATGCTGGGCAATCAATGTTTCT-3’，即 SEQ ID NO:2 ;且该靶序列选定在 111-211 之间。本专利技术还提供了一种为了检测该特定靶序列而设计的探针。首先选定用于识别和检测B族链球菌的靶序列，将该靶基因片段选定在111-211之间。将该短柄圆环探针序列设计成两部分，该短柄圆环探针序列包括两个序列，一个为圆环序列，为5’ -CCCCCCACGATACT-3’，即SEQ ID NO:3 ;一个为短柄序列，由位于该短柄圆环探针两端的另外六对互补碱基构成。因此，根据靶基因序列的探针设定也是本专利技术的要点。优选地，该圆环序列与选定的靶基因片段互补。优选地，所述短柄圆环探针的5’端标记FAM的荧光素，而3’端标记DABCYL淬灭剂。优选地，位于所述短柄圆环探针两端的另外六对互补碱基分别为:与所述圆环序列的5’端C相连的3’ -GCCGCC- 5’，即SEQ ID NO:4 ;与所述圆环序列的3’端T相连的5’ -CGGCGG -3’，即 SEQ ID NO:5。优选地，所述短柄圆环探针用于荧光检测。另外，本专利技术还提供了一种用于检测B族链球菌的试剂盒，该试剂盒每人份包括:2-5ml运输液，0.5-lml拭子洗脱液，Tris和5%-10%EDTA缓冲液，pH值在6-8之间；裂解液管，内装0.05-0.1ml玻璃珠；核酸扩增和杂交反应管，内装0.02-0.04ml的核酸扩增混和液、dNTP、内参照引物和探针、一对引物、和用于B族链球菌的短柄圆环探针；以及0.02-0.05ml自备试剂。 所述引物是为进行PCR扩增B族链球菌选定的靶序列而设计的引物:上游引物碱基序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物碱基序列如SEQ ID NO:2所示；所述用于B族链球菌的短柄圆环探针是这样的一个探针序列:该短柄圆环探针序列包括两个序列，一个为圆环序列，碱基序列如SEQ ID NO:3所示，一个为短柄序列，两端分别为:与所述圆环序列的5’端C相连的SEQ ID NO:4碱基序列；与所述圆环序列的3’端T相连的SEQID NO:5碱基序列。所述内参照引物取自拟南芥基因，所述内参照引物为:Suc-F:5’-CGTCGCTGGAGCTGGTTTAG-3，JPSEQ ID NO:6 ;Suc_R: 5，- CGGCGGTTTGCTAAGCTGAT-3，，即 SEQID NO:7 ;所述内参照探针为:5/ -AATCCGGTGGTGAT -3/，即 SEQ ID NO:8 ;内控引物Suc-F的特异结合区位于拟南芥基因的231~250位，共20个碱基，内控引物Suc-R的特异结合区位于拟南芥基因的1008~1027位，共20个碱基。优选地，所述运输液为经处理的高纯水、Tris-HCl、Triton X-100、或NaCl。优选地，所述运输液为3%_5%氯化钠，15%_20%牛肉粉，和6%_12%蛋白胨。所述氯化钠、牛肉粉和蛋白胨均可来源于市购。优选地，所述拭子洗脱液为2%-59ffiDTA。优选地，所述玻璃珠直径为0.1-0.25mm。优选地，试剂盒进一步包括0.02-0.05ml自备试剂； 优选地，所述自备试剂为石蜡油。优选地，试剂盒进一步包括阳性对照液及阴性对照液。阳性对照液制备由ATCC购得阳性菌株培养灭活所得，阴性对照液由医院获得阴性样本培养灭活所得。本专利技术与现有技术相比，具有以下特点和优点: 1.本专利技术对比专利号为“200410049736.4”的专利技术专利，针对的靶序列不相同，提供了一种可替代的优化的检测B族链球菌的引物、短柄圆环探针序列、以及对应的试剂盒，对B族链球菌的PCR荧光法检测技术起到推动作用。样品检测最快可以在2-3小时内完成，具有检测速度快、检测成本低的特点。2.根据本专利技术用于检测B族链球菌的试剂盒，具有灵敏性和特异性高、以及稳定性好的优点，有着广阔的市场应用前景；以及 3.根据本专利技术用于检测B族链球菌的试剂盒，可以供实验室和临床研究使用，并应用于普查和预防工作。【附图说明】图1是灵敏度参比品检测结果图； 图2是精密度参比品检测结果图； 图3是阳性准确性Z1-Z5参比品检测结果图； 图4是Z6-Z10阴性准确性参比品检测结果图； 图5是特异性Tl-TlO参比品检测结果图； 图6是试剂盒中阳性对照、临界阳性对照、阴性对照参比品检测结果图。【具体实施方式】如图1所示，本专利技术用于检测生物样本中B族链球菌的方法包括以下步骤: 1.本专利技术根据国际上报道的B族链球菌序列来选择靶点； 2.针对选定靶点设计引物和探针序列； 3.提取患者的DNA样本；以及 4.进行核酸扩增和杂交检测DNA样本中是否存在B族链球菌。通过以下对上述各个步骤的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种为进行PCR扩增B族链球菌选定的靶序列而设计的引物，所述引物为以下的一对序列：上游引物：5’?AGGAAGATTTATCGCACCTGAAAT?3’；下游引物：?5’?ATGCTGGGCAATCAATGTTTCT?3’。
【技术特征摘要】
1.一种为进行PCR扩增B族链球菌选定的靶序列而设计的引物，所述引物为以下的一对序列: 上游引物:5 ’ -AGGAAGATTTATCGCACCTGAAAT-3，； 下游引物:5’ -ATGCTGGGCAATCAATGTTTCT-3’。2.一种用于检测根据权利要求1所述的引物扩增的B族链球菌的短柄圆环探针，所述短柄圆环探针包括两个序列，一个为圆环序列，一个为短柄序列，所述圆环序列为:5’ -CCCCCCACGATACT -3’，所述短柄序列由位于所述短柄圆环探针两端的六对互补碱基构成。3.根据权利要求2所述的短柄圆环探针，其特征在于，所述圆环探针的5’端标记FAM的荧光素，而所述圆环探针的3’端标记DABCYL淬灭剂。4.根据权利要求2或3所述的短柄圆环探针，其特征在于，所述短柄序列为:与所述圆环序列的5 ’端C相连的3 ’ -GCCGCC -5 ’序列，和与所述圆环序列的3 ’端T相连的5 ’ -CGGCGG-3’序列。5.根据权利要求2或3所述的短柄圆环探针，其特征在于，所述短柄圆环探针用于荧光检测，所述圆环序列与靶序列是完全互补的序列。6.一种用于检测B族链球菌的试剂盒,其特征在于,包括:2-5ml运输液,0.5-...
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡晓沂，高建平，
申请(专利权)人：福州泰普生物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：
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