本发明专利技术属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒及其使用方法。试剂盒包括裂解液、清洗液1、清洗液2、清洗液3、洗脱液和磁珠悬浮液。本发明专利技术试剂盒的缓冲液体系配合特制的纳米级磁珠，可最大限度地去除样本的蛋白质、色素、脂类及其他抑制性杂质污染，从而使提取的DNA或RNA片段完整、产量高、纯度高、稳定可靠、成本低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学
，尤其涉及一种采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒及其使用方法。
技术介绍
核酸研究是现代生物学、医学研究中的重要课题。核酸作为遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础，除了在生物体正常的生长、发育、和繁殖等生命活动中具有十分重要的作用外，它与生命的异常情况，如肿瘤发生、放射损伤、遗传疾病等也有密切关系。因此核酸是现代生物学、医学研究中的重要课题。无论是进行核酸结构与功能的研究，还是进行基因工程、蛋白质工程等的研究，首先都需要对核酸进行分离纯化。在分子生物学研究的初期，核酸分离技术包含沉淀，离心等过程，这些纯化方法的步骤繁杂，费时长，接触有毒试剂，产物纯度和回收率难于满足实验要求，而且难以实现自动化和大规模运用。目前核酸分离技术虽然得到了很大的发展，但均存在一些缺点:例如， 有机法:有机法提取核酸一般是指用平衡酚、氯仿等按不同比例混合，提取核酸。有机法提取核酸应用范围广，适合各种生物样本，对富含蛋白质、多脂的生物样本更为有效。但是有机法应用有毒有机试剂，对人体有害，污染环境；多次换管，容易引起样本交叉污染。NaOH法=NaOH法提取DNA是通过强碱溶解、变性蛋白质，使细胞膜及核膜破坏，核酸酶变性，释放DNA。NaOH法提取DNA的主要缺点是DNA保存于碱中不稳定，4°C放置24h后PCR扩增不易成功，且不能用于提取RNA。 硅胶膜离心柱法:硅胶膜离心柱法提取核酸是通过异硫氰酸胍或盐酸胍等强烈蛋白变性剂的离液盐，破坏细胞膜及核膜蛋白，使核酸酶失活，释放核酸；然后硅胶膜可以特异性吸附核酸；通过离心和清洗液洗涤，在吸附核酸的硅胶膜上加入洗脱液，核酸释放于洗脱液中，经离心后，获得核酸溶液。其中，裂解液配方和用量、硅胶膜种类、洗脱液用量都会影响核酸纯化效果。硅胶膜离心柱法虽然是一种很好的核酸提取方法，但对试剂配制要求很严格，仍需多次离心，难于实现自动化。磁珠法提取核酸是近几年才发展起来的核酸提取方法，其采用纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。该提取方法不需要苯酚和氯仿等毒性大的有机溶剂，提取的核酸纯度高、产量高。磁珠微珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程，方法操作简单，不需要特殊的分离设备，实现自动化提取核酸。目前已有不少公司根据磁珠法的原理开发出了应用于核酸纯化的试剂盒，如Promega、Roche、Merck、Invitrogen等公司。这些试剂盒针对不同的材料来源设计了不同的提取方法，操作简单、高效，核酸质量较高，但价格昂贵。因此目前还需要开发一些操作简单、成本低、高效地提取DNA或RNA的核酸提取试剂盒。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种专门用于从血清或血浆等液体样本中快速地分离纯化微量病毒DNA或RNA，且环保、大通量、操作简单、成本低、提取的DNA或RNA质量好的采用磁珠法提取病毒核酸的试剂盒及其使用方法。本专利技术的技术方案为:一种采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒，所述试剂盒包括裂解液、清洗液1、清洗液2、清洗液3、洗脱液和磁珠悬浮液；其中， 清洗液2:体积分数为75%的乙醇水溶液； 清洗液3: 0.01-0.03 mol/L的Tris水溶液，pH值为4.0 5.0 ； 洗脱液:去离子水； 磁珠悬浮液:磁珠含量为40-60mg/ml，磁珠颗粒直径为1.5-2.5 μ m。所述裂解液的配置方法为:称取472.6 768.0g异硫氰酸胍或477.7 716.5g盐酸胍、12.Γ6.1g Tris或29.4 14.7g柠檬酸钠，用去离子水溶解后，调整pH至6.0 6.8，加入70 150ml Triton X_100、20ml 0.5M EDTA_2Na 和 50ml Acryl Carrier，混匀后，用去离子水定容至1000ml。所述清洗液I的配置方法为:称取472.6^590.1g异硫氰酸胍或382.2^573.2g盐酸胍、12.Γ6.1g Tri s或29.Γ14.7g柠檬酸钠，用去离子水溶解后，调整pH至6.(Γ6.8，加入350 600ml的无水乙醇,混勻后,用去离子水定容至1000ml。本专利技术所述采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒的使用方法，按照如下步骤进行: 1)在1.5ml的离心管中加入200ul血清/血浆样本和400_500ul的裂解液，迅速震荡混勻2min,再加入30_40ul磁珠悬浮液,55_60°C恒温干浴IOmin ； 2)将步骤I)中的离心管置于磁力架上，磁吸附l_2min，使磁珠完全吸附于离心管壁，吸弃除磁珠外的液体； 3)将经步骤2)处理的离心管从磁力架上取下，加入450-600ul清洗液1，涡旋混匀2min，将离心管置于磁力架上，磁吸附l_3min，吸弃除磁珠外的液体； 4)将经步骤3)处理的离心管从磁力架上取下，加入450-600ul清洗液2，涡旋混匀2min，将剩余的杂质溶解在清洗液2中，将离心管置于磁力架上，磁吸附l_3min，吸弃除磁珠外的液体； 5)将经步骤4)处理的离心管置于磁力架上，加入500-600ul清洗液3，进一步清洗剩余的杂质，吸弃除磁珠外的液体； 6)将经步骤5)处理的离心管从磁力架上取下，打开管盖，在室温下放置2min后，加入50-100ul洗脱液，室温或75-80°C震荡洗脱lOmin，使吸附在磁珠上的核酸解吸，进入洗脱液中； 7)将经步骤6)处理的离心管置于磁力架上，磁吸附l_3min，吸取收集除磁珠外的液体，并置于_20°C保存备用。步骤I)中，将血清/血浆样本和裂解液迅速震荡混匀，可快速裂解病毒包膜和衣壳，同时灭活核酸酶，释放内部的核酸；然后再加入磁珠悬浮液进行恒温干浴，使核酸被磁珠吸附，而蛋白质等其他杂质不被吸附。步骤3)中，加入清洗液I涡旋混匀，可使DNA/RNA分子中的磷酸二酯骨架脱水，彻底暴露出DNA/RNA分子。本专利技术所述的采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒的使用方法中，所述步骤O中的磁珠悬浮液使用前震荡混匀。所述步骤2)中吸弃除磁珠外的液体的操作在磁力架上完成。所述步骤5)中吸弃除磁珠外的液体的操作在磁力架上完成。所述步骤6)中，当单独提取病毒RNA时，洗脱温度为室温。所述步骤6)中，当单独提取病毒DNA，洗脱温度为75_80°C。本专利技术中，所述的磁珠悬浮液为市售产品，磁珠含量为40-60mg/ml,磁珠颗粒直径为1.5-2.5 μ m，磁珠固体由磁性核心和硅羟基涂层组成，悬浮于纯化水或20%乙醇溶液中，忙存在2_8°C ;其采购于德国Gerlinde Kisker公司、德国Chemagen公司、上海奥润微纳新材料科技有限公司或其他符合技术要求的公司。所述Tris为三羟甲基氨基甲烷。 本专利技术采用独特的裂解液配方(其内含有离液盐和表面活性剂)，快速地裂解病毒包膜和衣壳，释放内部的核酸，在合适的缓冲体系中，通过特制的微米级磁珠，吸附游离的病毒核酸；再经磁分离和清洗液清洗，清除样本中的蛋白质、色素、脂类及其他抑制性杂质；最后使用洗脱液将核酸从磁珠表面洗脱下来。采用本专利技术的技术方案，具有如下的优点: 1、本专利技术的试剂盒可采用常温运输，2-8 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括裂解液、清洗液1、清洗液2、清洗液3、洗脱液和磁珠悬浮液；其中，清洗液2：体积分数为75%的乙醇水溶液；清洗液3：?0.01?0.03?mol/L的Tris水溶液，pH值为4.0~5.0；?洗脱液：去离子水；磁珠悬浮液：磁珠含量为40?60mg/ml，磁珠颗粒直径为1.5?2.5μm。
【技术特征摘要】
2012.11.26 CN 201210484419.X1.一种采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括裂解液、清洗液1、清洗液2、清洗液3、洗脱液和磁珠悬浮液；其中， 清洗液2:体积分数为75%的乙醇水溶液； 清洗液3: 0.01-0.03 mol/L的Tris水溶液，pH值为4.0 5.0 ； 洗脱液:去离子水； 磁珠悬浮液:磁珠含量为40-60mg/ml，磁珠颗粒直径为1.5-2.5 μ m。2.根据权利要求1所述的采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒，其特征在于，所述裂解液的配置方法为:称取472.6 768.0g异硫氰酸胍或477.7 716.5g盐酸胍、12.Γ6.1gTris或29.Γ14.7g柠檬酸钠，用去离子水溶解后，调整pH至6.0 6.8，加入7(Tl50mlTriton X_100、20ml 0.5M EDTA_2Na 和 50ml Acryl Carrier，混匀后，用去离子水定容至IOOOml03.根据权利要求1所述的采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒，其特征在于，所述清洗液I的配置方法为:称取472.6 590.1g异硫氰酸胍或382.2 573.2g盐酸胍、12.Γ6.1g Tris或29.4 14.7g柠檬酸钠，用去离子水溶解后，调整pH至6.0 6.8，加入350 600ml的无水乙醇,混勻后,用去离子水定容至1000ml。4.权利要求1所述采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒的使用方法，其特征在于，按照如下步骤进行: 1)在1.5ml的离心管中加入200ul血清/血浆样本和400_500ul的裂解液，迅速震荡混勻2min,再加入30_4 0ul磁珠悬...
【专利技术属性】
技术研发人员：李旭新，杨玉芬，
申请(专利权)人：福州泰普生物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：
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