一种基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术提出了一种基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法，通过不对称PCR扩增目标基因获取单链目标DNA，采用分支DNA放大信号原理设计针对目标DNA特异性序列的电化学发光核酸检测探针组，单链目标DNA与电化学发光核酸检测探针组杂交，对杂交产物进行电化学发光检测，根据电化学发光信号的有无和强度对目标DNA进行定性与定量分析，最终实现目标基因的检测。本发明专利技术还提供一种采用上述方法进行核酸检测的试剂盒，具有反应灵敏，检测速度快，结果准确的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法及试剂盒
本专利技术涉及分子生物学及核酸检测
，特别是指一种基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法，本专利技术还涉及基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测试剂盒。
技术介绍
近年来，核酸检测(nucleicacidtesting，NAT)在感染性疾病的预防和控制、恶性肿瘤的早期诊断及精准治疗、遗传性疾病的早期筛查、动植物病毒的预防与控制、转基因检测等方面发挥着重要作用。当前，核酸检测的主要方法有基因芯片、原位杂交以及PCR等。基于核酸杂交的基因生物传感器是近年来发展最迅速的核酸检测方法之一。其中电化学发光基因传感器将电化学发光方法的快速灵敏和核酸分子杂交的高度序列特异性结合起来，可实现核酸的快速、灵敏、准确检测。新近发展起来的分支DNA(branchedDNA,bDNA)信号放大技术是一项以微孔形式进行特异性核苷酸检测的扩增技术。它原理是：利用碱性磷酸酶标记的寡脱氧核苷酸探针在组织或细胞水平上与基因或病原体核苷酸依序杂交，使杂交信号级联放大，获得化学发光信号，并通过化学发光仪读取发光值，再根据已知浓度标准品绘制的标准曲线，计算目标DNA的拷贝数，从而实现定性或者定量检测。bDNA技术具有显著的优点：采用释放剂直接释放目标DNA，避免了DNA的提取，节省了时间；无需扩增，避免了PCR反应过程中因为操作不当或实验环境污染可能引起的假阳性；设备要求不高，成本更低廉；操作简便，实验步骤简单，可实现自动化检测。虽然bDNA技术在原理上已经有一定的探明，但实际的使用上，却并没有获得大面积的推广，原因在于从理论到实际使用中，存在诸多的技术难点，比如，实际使用时的缓冲液体系的构建、放大探针组的设计等，都会直接影响到使用的效果，而现实中，虽然有部分相关的产品，但仅限于仅有的几个厂家，每个厂家对于bDNA技术所需缓冲液成分并未说明，所涉及放大探针组的设计方法，以及具体序列也并未公开，而是采取了技术秘密的保护方式，另外，当前电化学发光(electrochemiluminescence,ECL)技术的具体实验做法并未开放，里面涉及到的发光标记探针具体合成方法鲜有公开，造成电化学发光的实际研究与使用具有很多难点需要去面对和解决，同时电化学发光也需要使用到专门的电化学发光仪，而它的研发需要物理、化学、生物和电子等知识，这也极大的限制了ECL技术的应用。进而，将核酸检测、bDNA技术和ECL技术联用，要求对所需探针序列十分清楚，以免产生非特异性杂交、识别等问题，就目前而言，这两种技术所涉及序列均公开较少，限制了这两种技术联用，尤其是这两种技术联用在核酸检测领域。
技术实现思路
本专利技术将电化学发光检测方法快速灵敏的优点和bDNA技术信号放大的优势相结合，提出的一种基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法，并将该法应用于病原微生物、转基因等检测。本专利技术的技术方案是这样实现的：一种基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法，通过不对称PCR扩增目标基因获取单链目标DNA，采用分支DNA放大信号原理设计针对目标DNA特异性序列的电化学发光核酸检测探针组，单链目标DNA与电化学发光核酸检测探针组杂交，对杂交产物进行电化学发光检测，根据电化学发光信号的有无和强度对目标DNA进行定性与定量分析，最终实现目标基因的检测。进一步，步骤为，提取目标DNA，引物设计修饰、捕获探针组特征序列的设计与合成、放大探针组的设计与合成、发光探针设计与合成和不对称PCR反应，再通过探针组杂交及磁珠孵育与分离，对磁珠进行电化学发光检测，根据电化学发光信号的有无和强度对目标DNA进行定性与定量分析，最终实现目标基因的检测。更为具体的，所述基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法，包括步骤：(1)从待测样品中提取目标DNA：提取目标DNA方法根据检测物的不同，提取方法也不同；(2)根据目标基因序列设计引物并对上游引物5’端进行生物素修饰：引物的修饰便于与链霉亲合素修饰的磁珠连接起来，引物的设计主要利用premier5设计以及GenebankBLAST特异性分析；(3)检测探针组的设计与合成，包括：捕获探针组特征序列的设计与合成，根据分支DNA原理对放大探针组进行设计与合成，所述放大探针组包括捕获探针通用序列、前放大探针、放大探针和发光标记探针，发光探针上进行发光物标记。捕获探针组特征序列的设计与合成：特征部分序列的设计主要依据premier5以及GenebankBLAST特异性分析；根据分支DNA原理对放大探针组进行设计与合成：放大探针组的设计主要利用premier5设计以及GenebankBLAST特异性分析，要综合探针长度、退火温度、探针错配、二聚体和特异性等相关因素，经过多重筛查，最终确定具体序列；发光探针设计与合成：遵循碱基互补配对原则，并考虑与其他探针错配，以及自身特异性分析，同时在探针末端修饰氨基、羧基、巯基等活性基团，便于接上发光标记物。(4)采用不对称PCR扩增目标基因，获取5’端标记生物素的单链目标DNA：因不同的检测目标DNA，所需不对称比例也不一定相同，一般而言，上、下游引物按照1:1至200：1比例进行不对称PCR，进而筛选出最优的上游引物扩增的单链DNA片段；(5)5’端标记生物素的单链目标DNA与检测探针组杂交：按照捕获探针-前放大探针杂交、前放大探针-放大探针杂交、目标DNA-捕获探针杂交和放大探针-发光标记探针杂交依次进行，条件可为50-60℃，30-50min；(6)杂交产物与链霉亲和素修饰磁珠孵育，去上清液，收集磁珠并将其分散于缓冲液中，孵育条件可为37℃，15-30min；(7)对磁珠进行电化学发光检测：发光检测包括：电化学发光、化学发光、荧光等；(8)根据电化学发光信号值是否高于阈值判断样品中是否含有目标DNA成分；(9)制定标准曲线，根据标准曲线对阳性样品中的目标DNA成分进行定量分析。进一步，步骤(1)中，所述DNA可为肿瘤标记物的DNA、病原微生物DNA和转基因生物DNA，也适用于病毒核酸等。进一步，步骤(3)中，捕获探针包括特征序列和通用序列，通用序列为所有检测目标共用，特征序列为针对不同目标DNA而设计的特异性序列；放大探针组包括的捕获探针为捕获探针的通用序列。进一步，步骤(3)中，发光探针不局限于钌探针，也可用诸如鲁米诺、吖啶类、过氧化草酸酯类、稠环芳烃类以及量子点类其他电化学发光探针，以及CdTe、CdSe、CdS、ZnS、C3N4、铽、氧化石墨烯等量子点荧光探针，化学发光探针等；为便于核酸和上述标记物连接，可在探针末端修饰氨基、羧基、巯基等活性基团。进一步，步骤(6)中，杂交产物通过单链目标DNA上修饰的生物素和链霉亲和素修饰的磁珠连接。本专利技术的另一个目的在于提出一种所述基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法得到的核酸检测试剂盒，检测简便，快速，成本低，其中包括目标DNA序列引物、放大探针组、DNA聚合酶、MgSO4、dNTP、10×PCRBuffer、Marker、阳性对照和阴性对照。进一步，所述基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测试剂盒中，所述放大探针组序列如下：前放大探针序列为SEQIDNO：1；捕获探针序列通本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法，其特征在于：通过不对称PCR扩增目标基因获取单链目标DNA，采用分支DNA放大信号原理设计针对目标DNA特异性序列的电化学发光核酸检测探针组，单链目标DNA与电化学发光核酸检测探针组杂交，对杂交产物进行电化学发光检测，根据电化学发光信号的有无和强度对目标DNA进行定性与定量分析，实现目标基因的检测。

【技术特征摘要】
1.一种基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法，其特征在于：通过不对称PCR扩增目标基因获取单链目标DNA，采用分支DNA放大信号原理设计针对目标DNA特异性序列的电化学发光核酸检测探针组，单链目标DNA与电化学发光核酸检测探针组杂交，对杂交产物进行电化学发光检测，根据电化学发光信号的有无和强度对目标DNA进行定性与定量分析，实现目标基因的检测。2.如权利要求1中所述基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法，其特征在于包括如下步骤：(1)从待测样品中提取目标基因DNA；(2)根据目标基因序列设计引物并对上游引物5’端进行生物素修饰；(3)检测探针组的设计与合成，包括：捕获探针组特征序列的设计与合成，根据分支DNA原理对放大探针组进行设计与合成，所述放大探针组包括捕获探针通用序列、前放大探针、放大探针和发光标记探针，发光探针上进行发光物标记。(4)采用不对称PCR扩增目标基因，获取5’端标记生物素的单链目标DNA；(5)5’端标记生物素的单链目标DNA与检测探针组杂交；(6)杂交产物与链霉亲和素修饰磁珠孵育，去上清液，收集磁珠并将其分散于缓冲液中；(7)对磁珠进行电化学发光检测；(8)根据电化学发光信号值是否高于阈值判断样品中是否含有目标DNA成分；(9)制定标准曲线，根据标准曲线对阳性样品中的目标DNA成分进行定量分析。3.如权利要求1中所述基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述目标DNA包括：肿瘤标志物DNA、病原微生物DNA、转基因生物DNA、病毒核酸。4.如权利要求1中所述基于分支DNA放...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱德斌，刘岩，曹玉娟，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东,44