本发明专利技术提供一种可用于测定孕妇血浆中胎儿游离DNA浓度的试剂盒，该试剂盒包含用于对从孕妇血浆中提取的游离DNA进行消化的甲基化酶；用于测定从孕妇血浆中提取的游离DNA的浓度的试剂；以及，用于测定经所述甲基化酶消化后的从孕妇血浆中提取的游离DNA的浓度的试剂。采用本发明专利技术的试剂盒对孕妇血浆中胎儿游离DNA的浓度进行测定时，测定值与真实值之间具有良好的相关性。本发明专利技术的引物组由上游引物及下游引物组成，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
【技术实现步骤摘要】
具体而言，本专利技术涉及用于PCR扩增人PDE9A基因的引物组、包含该引物组的用于测定孕妇血浆中胎儿游离DNA浓度的试剂盒及使用该引物组的PCR扩增方法。
技术介绍
自从孕妇血浆的游离DNA(cfDNA，cellfreeDNA)中存在胎儿游离DNA(cellfreefetalDNA)这个现象被发现以来，研究者们就利用这个现象来进行多种研究和应用，例如无创产前DNA检测、胎儿性别确定、胎儿染色体异常检测、单基因遗传病筛查、妊娠相关疾病筛查等。目前有通过检测SRY基因来确定孕妇血浆中胎儿游离DNA的浓度的方法，但是SRY基因是男胎特有基因，对于孕有女胎的孕妇来说就无法检测出胎儿游离DNA的浓度。后来，科学家们通过甲基化测序等手段发现孕妇和胎儿基因组在甲基化水平上差异很大，从而找到了一些胎儿特异性的甲基化基因，目前检测胎儿游离DNA浓度的方法就集中在检测甲基化差异方面。PDE9A基因位于21q22.3，在孕妇外周血中为甲基化状态，而在胎儿组织中为非甲基化状态。理论上，孕妇血浆中的胎儿游离DNA(cffDNA)可以通过胎儿特异的表观遗传学标记——非甲基化的PDE9A基因(U-PDE9A)来测定。U-PDE9A也可以作为无创检测21三体的一个标志物。利用甲基化敏感酶消化后，来自胎儿的PDE9A基因被消化降解掉，游离DNA中只剩下来自母亲的PDE9A基因。通过这种方法我们可以有效的检测孕妇血浆中游离DNA含量，准确的检测孕妇血浆中胎儿游离DNA的浓度，有助于为目前的无创产前筛查方法提供指导和理论依据。然而，作为一种有临床应用价值的cffDNA检测方法，需要保证测定值与真实值之间有良好的相关性(R2值接近1)。因此，上述理论上可行的方法离实际应用还相去甚远。备注：cffDNA，表示的是cellfreefetalDNA，游离胎儿DNA；而cfDNA是cellfreeDNA，游离DNA。参考文献[1]PresenceoffetalDNAinmaternalplasmaandserum.Lancet1997.350:485-487.[2]Cell-freefetalDNAplasmaextractionandreal-timepolymerasechainreactionquantification.MethodsMolMed2007.132:51-63.[3]QuantificationofCell-freeDNAinnormalandcomplicatedpregnancies:overcomingbiologicalandtechnicalissues,PLoSOne2014.9(7):1-7.[4]Cell-freeFetalDNAandCell-FreeTotalDNAlevelsinspontaneousabortionwithfetalchromosomalaneuploidy,PLoSOne2013.8:2.[5]Non-invasiveepigeneticdetectionoffetaltrisomy21infirsttrimestermaternalplasma.PLoSOne2011.6(11):e27709.[6]Non-invasiveprenatalaneuploidytestingatchromosomes13,18,21,X,andY,usingtargetedsequencingofpolymorphicloci.PrenatDiagn2012.32(13):1233-1241.
技术实现思路
鉴于上述现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种能够使得胎儿游离DNA的测定值与真实值之间有良好的相关性的、用于测定孕妇血浆中胎儿游离DNA浓度的试剂盒。本专利技术人为解决上述技术问题进行了深入研究，结果发现：通过使用特定用于测定孕妇血浆中胎儿游离DNA浓度的试剂盒，可以使采用Q-PCR方法获得的胎儿游离DNA的测定值与真实值之间具有良好的相关性，从而完成了本专利技术。即，本专利技术包括：1.一种引物组，其由上游引物及下游引物组成，所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。2.根据项1所述的引物组，其用于扩增人PDE9A基因。3.根据项2所述的引物组，其中，所述人PDE9A基因来源于孕妇血浆游离DNA。4.一种用于扩增人PDE9A基因的试剂盒，其包含项1-3任一项所述的引物组。5.根据项4所述的试剂盒，其还包含核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的绝对定量用标准品。6.一种扩增人PDE9A基因的方法，其使用项1-3任一项所述的引物组作为引物进行PCR扩增。7.根据项6所述的方法，其使用从孕妇血浆中提取的游离DNA作为模板。8.根据项6所述的方法，其使用经甲基化酶消化的从孕妇血浆中提取的游离DNA作为模板。9.根据项6所述的方法，其中，所述PCR扩增的变性温度为93℃-98℃，优选94℃-96℃。10.根据项6所述的方法，其中，所述PCR扩增的退火温度为52℃-62℃，优选55℃-60℃。11.根据项6所述的方法，其中，所述PCR扩增的延伸温度为72℃。12.一种用于测定孕妇血浆中胎儿游离DNA浓度的试剂盒，其包含权利要求1所述的引物组。13.根据项12所述的试剂盒，其还包含核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的绝对定量用标准品。14.一种用于测定孕妇血浆中胎儿游离DNA浓度的试剂盒，其包括：用于对从孕妇血浆中提取的游离DNA进行消化的甲基化酶。15.根据项14所述的试剂盒，其还包括：用于测定从孕妇血浆中提取的游离DNA的浓度的试剂；以及用于测定经所述甲基化酶消化后的从孕妇血浆中提取的游离DNA的浓度的试剂。16.根据项14所述的试剂盒，其还包括下述引物组：所述引物组由上游引物及下游引物组成，所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。17.根据权利要求14所述的试剂盒，其还包含核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的绝对定量用标准品。18.根据权利要求14所述的试剂盒，其中，所述甲基化酶是选自BstUI、HhaI和HpaII中的一种或多种。专利技术效果通过使用本专利技术的用于测定孕妇血浆中胎儿游离DNA浓度的试剂盒，能够使采用Q-PCR方法获得的胎儿游离DNA的测定值与真实值之间具有良好的相关性。附图说明图1显示了使用本专利技术的引物组扩增人PDE9A基因的情况下，采用Q-PCR方法获得的胎儿游离DNA的测定值与真实值之间具有良好的相关性。图2显示了使用对比例的引物组扩增人PDE9A基因的情况下，采用Q-PCR方法获得的胎儿游离DNA的测定值与真实值之间的相关性不良。专利技术的具体实施方式在一个方面中，本专利技术提供一种引物组(本专利技术的引物组)，其由上游引物及下游引物组成，所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。SEQIDNO：15’-TCGGTGAGTGCGCGCTGC-3’(也称作PDE9A-FS)SEQIDNO：25’-CAGCCATCCCGAAAAGGCGA-3’(也称作PDE9A-RS)所述引物组可以在针对人P本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于测定孕妇血浆中胎儿游离DNA浓度的试剂盒，其包括：用于对从孕妇血浆中提取的游离DNA进行消化的甲基化酶；用于测定从孕妇血浆中提取的游离DNA的浓度的试剂；以及用于测定经所述甲基化酶消化后的从孕妇血浆中提取的游离DNA的浓度的试剂。
【技术特征摘要】
1.一种用于测定孕妇血浆中胎儿游离DNA浓度的试剂盒，其包括：用于对从孕妇血浆中提取的游离DNA进行消化的甲基化酶；用于测定从孕妇血浆中提取的游离DNA的浓度的试剂；以及用于测定经所述甲基化酶消化后的从孕妇血浆中提取的游离DNA的浓度的试剂。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其还包括下述引物组：所述引物组由上游引物及下游引物组成，所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其还包含核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的绝对定量用标准品。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述甲基化酶是选自BstUI、...
【专利技术属性】
技术研发人员：洪燕，王白云，徐护朝，玄兆伶，李大为，梁峻彬，陈重建，
申请(专利权)人：安诺优达基因科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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