一种测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒以及应用与方法技术

本发明专利技术公开了一种测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒以及应用与方法，涉及生物检测技术领域。本发明专利技术提供的测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒以及方法能对猪细小病毒样本的TCID50进行测定。本发明专利技术提供的试剂盒以及方法对猪细小病毒的TCID50进行测定，通过吸光值判断敏感细胞是否发生病变，计算发生病变的阳性率，从而计算出猪细小病毒的TCID50，克服了现有技术测定猪细小病毒样本的TCID50测定结果不准确，花费时间长的缺陷，实现对猪细小病毒样本的TCID50准确、快速测定。

Reagent kit for detecting porcine parvovirus TCID50 and application and method thereof

The invention discloses a kit for detecting TCID50 of porcine parvovirus and an application and a method thereof. The invention provides a kit for detecting TCID50 of porcine parvovirus and a method for measuring the TCID50 of porcine parvovirus samples. TCID50 kit and method provided by the invention of porcine parvovirus were measured by light absorption value judgment whether sensitive cell lesions, calculated the positive rate of diseases, so as to calculate the porcine parvovirus TCID50, overcomes the determination of porcine parvovirus TCID50 of the sample test results is not accurate, the defect takes time the realization of Porcine Parvovirus TCID50 samples of accurate and rapid determination.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测
，具体而言，涉及一种测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒以及应用与方法。
技术介绍
猪细小病毒(Porcineparvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，最早于1966年在用猪肾原代细胞培养猪瘟病毒时被首先发现，1967年从繁殖障碍母猪流产和死产胎儿中分离到该病毒，从而首次证明了它的致病作用。猪是PPV唯一易感动物，该病毒主要侵害母猪，特别是初产母猪及血清学阴性经产母猪，造成死胎、木乃伊胎、畸形胎、流产、死产及产弱仔猪等，但母猪本身无明显症状；也可引起仔猪的腹泻、皮炎及关节炎。我国已经先后在北京、上海、湖北、河南等多地发生该病的流行。随着大型集约化养猪场的大量出现，该病呈现上升趋势，给养猪业造成巨大的经济损失。针对该病尚无有效的治疗药物，世界范围内多采用疫苗免疫来控制本病的流行。目前，国内广泛使用PPV灭活苗来预防该病的发生，而评价PPV灭活疫苗的保护效果主要取决于疫苗中病毒的效价。因此寻求一个简单、快速、灵敏、精准的病毒效价测定方法对PPV疫苗生产工艺具有很重大的意义。目前在疫苗生产过程中，多使用PK15和ST细胞来增殖病毒，而测定病毒效价最经典、最常用的方法是TCID50方法。TCID50(Tissuecultureinfectivedose)，又称50％组织细胞感染量，即指能使半数组织细胞培养物感染的病毒量，可反应病毒感染性的强弱，但不准确测定感染性病毒颗粒的数量。由于PPV在细胞上增殖引起的细胞病变出现慢且不如猪伪狂犬病毒、猪乙脑病毒等产生的细胞病变易观察，利用现有技术中的方法测定猪细小病毒样本的TCID50耗时长，平均5-6天，而且需要用肉眼在显微镜下观察是否发生病变，从而计算感染病毒发生病变的病变率，容易造成病变结果的漏检，统计出错误的病变率，导致得出不准确的TCID50。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒，该试剂盒对猪细小病毒TCID50的测定是通过吸光值判断敏感细胞是否发生病变，计算发生病变的阳性率，从而计算出猪细小病毒的TCID50，具有准确、快速的特点。本专利技术的另一目的在于提供上述试剂盒在测定猪细小病毒的TCID50中的应用。采用上述试剂盒对猪细小病毒的TCID50的测定是通过吸光值判断敏感细胞是否发生病变，计算发生病变的阳性率，从而计算出猪细小病毒的TCID50，具有准确、快速的特点。本专利技术的再一目的在于提供一种测定猪细小病毒的TCID50的方法，该方法与上述测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒联用，实现对猪细小病毒的TCID50的测定，通过吸光值判断敏感细胞是否发生病变，计算发生病变的阳性率，从而计算出猪细小病毒的TCID50，具有准确、快速的特点。本专利技术解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。一种测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒，其包括用于固定猪细小病毒的固定液和用于结合猪细小病毒的抗体，抗体标记有用于催化底物显色的催化酶。上述测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒在测定猪细小病毒的TCID50中应用。一种测定猪细小病毒的TCID50的方法，其包括：将待测猪细小病毒样本接种至含有敏感细胞的培养液中，进行病毒培养。往经过病毒培养后的敏感细胞中加入用于固定猪细小病毒的固定液进行固定处理。经固定处理后，加入标记有用于催化底物显色的催化酶的抗体及含有底物的显色液，进行显色反应。于预设波长下测定待测猪细小病毒样本的吸光值，根据吸光值判断敏感细胞是否发生病变。本专利技术实施例的一种测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒以及应用与方法的有益效果是：本专利技术提供的试剂盒以及方法对猪细小病毒样本的TCID50进行测定，通过吸光值判断敏感细胞是否发生病变，计算发生病变的阳性率，从而计算出猪细小病毒样本的TCID50，由于本专利技术是通过吸光值判断敏感细胞是否发生病变，其具有判断准确、可靠的特点，进而克服了现有技术测定猪细小病毒样本的TCID50时需要用肉眼在显微镜下观察是否发生病变，从而导致测定结果不准确的缺陷，同时，本专利技术提供的试剂盒以及方法对猪细小病毒样本的TCID50进行测定花费时间短，克服了现有技术测定时间长的缺陷，实现对猪细小病毒样本的TCID50准确、快速的测定。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本专利技术实施例的一种测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒以及应用与方法进行具体说明。一种测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒，其包括用于固定猪细小病毒的固定液和用于结合猪细小病毒的抗体，抗体标记有用于催化底物显色的催化酶。优选地，固定液由甲醇和丙酮按体积比为0.8-1.2:1的比例配制而成。更优选地，固定液由甲醇和丙酮按体积比为1:1的比例配制而成。由甲醇和丙酮按体积比为0.8-1.2:1的比例配制的固定液，可以防止细胞发生自溶并保存细胞固有物质，使细胞基本上保持与生活时的物质一致。优选地，上述抗体为抗猪细小病毒的抗体，催化酶为辣根过氧化物酶。更优选地，上述抗猪细小病毒的抗体选自兔源、猪源、小鼠源或大鼠源的抗猪细小病毒单克隆抗体中的任意一种。或者上述抗猪细小病毒的抗体选自兔源、猪源、小鼠源或大鼠源的抗猪细小病毒多克隆抗体中的任意一种。优选地，本专利技术提供的试剂盒还包括抗猪细小病毒的第一抗体，上述抗体为抗第一抗体的第二抗体，催化酶为辣根过氧化物酶。更优选地，上述第一抗体选自兔源、猪源、小鼠源或大鼠源的抗猪细小病毒单克隆抗体中的任意一种；或者上述第一抗体选自兔源、猪源、小鼠源或大鼠源的抗猪细小病毒多克隆抗体中的任意一种。上述第二抗体选自兔源、猪源、小鼠源或大鼠源的抗抗猪细小病毒抗体的单克隆抗体中的任意一种；或者上述第二抗体选自兔源、猪源、小鼠源或大鼠源的抗抗猪细小病毒抗体的多克隆抗体中的任意一种。需要说明的是，本专利技术提供的试剂盒还可以包括显色液、洗涤液、终止液、封板膜中的一种或多种。显色液中包括被催化酶催化显色的底物，本专利技术实施例中提供的显色底物是辣根过氧化物酶常用的底物四甲基联苯胺(TMP)，其被辣根过氧化物酶催化显色后的测定波长为450nm。洗涤液为含体积分数0.04-0.06％的Tween-20的磷酸缓冲液(PBST)。终止液为浓酸或浓碱。本专利技术还提供一种测定猪细小病毒的TCID50的方法，其包括：将待测猪细小病毒样本接种至含有敏感细胞的培养液中，进行病毒培养。具体地：用稀释液将待测猪细小病毒样本梯度稀释后接种到含有敏感细胞的细胞培养板中，每个梯度浓度设置多个重复孔，进行病毒培养，同时设置阴性对照孔和阳性对照孔。其中，阴性对照组中不接种病毒，加入相同体积的稀释液；阳性对照组中接种相同体积的已知效价的病毒液。同时设立三组平行实验。优选地，在进行病毒培养之前，还包括敏感细胞的培养。敏感细胞的培养包括：取传代后的敏感细胞，培养至细胞汇合度达到90％以上时，弃去细胞培养液；使用PBS洗涤三次，加入EDTA-胰酶溶液消化1-5分钟；弃去EDTA-胰酶溶液，加入10mL细胞传代培养液吹打细胞使细胞从细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒，其特征在于，其包括用于固定猪细小病毒的固定液和用于结合所述猪细小病毒的抗体，所述抗体标记有用于催化底物显色的催化酶。

【技术特征摘要】
1.一种测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒，其特征在于，其包括用于固定猪细小病毒的固定液和用于结合所述猪细小病毒的抗体，所述抗体标记有用于催化底物显色的催化酶。2.根据权利要求1所述的测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒，其特征在于，所述固定液由甲醇和丙酮按体积比为0.8-1.2:1的比例配制而成。3.根据权利要求1所述的测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒，其特征在于，所述抗体为抗猪细小病毒的抗体，所述催化酶为辣根过氧化物酶。4.根据权利要求1所述的测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括抗猪细小病毒的第一抗体，所述抗体为抗所述第一抗体的第二抗体，所述催化酶为辣根过氧化物酶。5.根据权利要求1-4中任一项所述的测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒，其特征在于，所述抗体的种属来源是兔源、猪源、小鼠源或大鼠源中的任意一种。6.权利要求1-5中任一项所述的测定猪细小病毒的TCID50的试剂盒在测定猪细小病毒样本的TCID50中的应用。7.一种测定猪细小病毒的TCID50的方法，其特征在于，其包括：将待测猪细小病毒样本接种至含有敏感细...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡雨函，周远成，王翱，李碧，卓秀萍，牛婷，钟颖，阴文奇，邝声耀，
申请(专利权)人：四川华神兽用生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51