一种精确测定病源细胞的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种精确测定病源细胞的试剂盒及其应用。本发明专利技术提供了一种检测病源细胞的试剂盒，包括：检测病源细胞的靶向性分子和非特异性信号监测寡核苷酸探针。所述非特异性信号监测寡核苷酸探针可监测靶向性分子的寡核苷酸部分与细胞结合产生的非特异性信号。本发明专利技术的方法有效降低非特异性结合导致的干扰，提高了检测病源细胞的准确性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于病源细胞诊断领域，更具体地，本专利技术涉及一种精确测定病源细胞的试剂盒及其应用。
技术介绍
对病源细胞的定量检测是准确判断患者病情并给予及时治疗的直接证据。例如，血液中循环肿瘤细胞的数量是决定病人预后的重要因素。同样，对血液中的疟原虫的检测也是判断疟疾病情的重要指标。传统的检测方法基本是基于对病源细胞表面抗原的检测和定量。在这些方法中，抗体首先被附着在一个固体载体上，由于抗体-抗原的相互作用抗体和待检测细胞形成复合物。同样的原理，抗体可能先通过抗原-抗体反应和待检细胞形成复合物，然后再附着到一个固体载体上。其后，被抗体抓住的细胞被收集和标记以此来定量。比如免疫荧光技术检测循环肿瘤细胞。首先用附着于磁珠或微流体芯片的抗体将肿瘤细胞从血液中富集出来。然后用带有标记物、肿瘤细胞特异性的抗体标记肿瘤细胞并进行定量检测。一般来说，标记物包括放射性的同位素，染料，荧光素和酶(用于酶标反应)等。尽管基于抗原捕获的检测方法在临床上应用广泛，但是这些方法有许多不足之处，包括检测灵敏度低、通量低、操作麻烦且人为误差大等。本专利技术人前期的专利《检测病源细胞的靶向性分子及其应用》(申请号201110315281.6)，提供了一种检测病源细胞的靶向性分子，其结构为X-Y，其中X代表特异性靶向病源细胞的结合分子，Y代表寡核苷酸探针，通过对寡核苷酸探针进行荧光定量PCR扩增，实现信号放大，提高了病源细胞表面特定结合分子的检测灵敏度，达到对待检病源细胞进行定量的目的。但是，本专利技术人在研究中发现：(1)在对病源细胞进行富集后的产物中，除了包含病源细胞外，还包含其他无关细胞。比如在对血液样本中的循环肿瘤细胞(CTC)进行富集后，除了CTC外，还含有大量白细胞。此外，对于多数良性病患者，由于存在炎症反应，白细胞数量也会显著高于正常值。由于这些病源细胞和无关细胞表面可能存在DNA受体的表达，因此可与靶向性分子的寡核苷酸探针部分结合，产生非特异性的结合信号，影响检测的准确性。(2)由于样本质量问题，如血液样本保存时间超过24小时或保存温度不当，容易导致细胞结团，亦会增加对靶向性分子寡核苷酸部分的非特异性结合。因此，有必要开发新的检测试剂或方法，以提高检测的特异性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种精确测定病源细胞的试剂盒及其应用。在本专利技术的第一方面，提供一种检测病源细胞的试剂盒，所述试剂盒中包括：检测病源细胞的靶向性分子，结构为X-Y；其中，X代表特异性靶向病源细胞的结合分子；Y代表寡核苷酸探针；“-”代表X和Y之间的共价连接、偶联或偶合的关系；和非特异性信号监测寡核苷酸探针Y’，Y’的序列长度和序列信息与Y相似，但与Y在序列信息上存在部分碱基的不同。在一个优选例中，Y’与Y的序列长度差异≤30％，Y’与Y的序列中GC％差异≤30％。在另一优选例中，Y或Y’的序列长度为10-150bp(双链)或10-150nt(单链)。在另一优选例中，Y’的序列长度为11-120bp(双链)或11-120nt(单链)；如12bp(双链)或12nt(单链)；14bp(双链)或14nt(单链)；16bp(双链)或16nt(单链)；18bp(双链)或18nt(单链)；20bp(双链)或20nt(单链)；30bp(双链)或30nt(单链)；40bp(双链)或40nt(单链)；50bp(双链)或50nt(单链)；60bp(双链)或60nt(单链)；80bp(双链)或80nt(单链)；100bp(双链)或100nt(单链)。在另一优选例中，当Y或Y’的序列长度为10-50bp(双链)或10-50nt(单链)时，Y’与Y在序列信息上存在2-6个，较佳地3-5个碱基的不同；当Y或Y’的序列长度为51-100bp(双链)或51-100nt(单链)时，Y’与Y在序列信息上存在3-30个、较佳地5-20个碱基的不同；当Y或Y’的序列长度为101-150bp(双链)或101-150nt(单链)时，Y’与Y在序列信息上存在3-45个，较佳地5-35个碱基的不同。在另一优选例中，所述的试剂盒中，X选自：特异性靶向病源细胞的抗体、配体、化学小分子或多肽。在另一优选例中，所述的病源细胞是肿瘤细胞，X是叶酸或叶酸-半胱氨酸偶联物；更佳地，所述的肿瘤细胞是循环肿瘤细胞。在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针的序列中，磷酸键上存在硫代修饰。在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：针对Y的延伸引物，该延伸引物序列结构如下：A-B；其中，A为随机序列，B序列与Y序列的其中一个末端(如3’端)的序列互补；和针对Y’的延伸引物，该延伸引物序列结构如下：A-B’；其中，A的定义如前，B’序列与Y’序列的其中一个末端(如3’端)的序列互补。在另一优选例中，当靶向性分子的寡核苷酸部分较短，如<50bp，设置该延伸引物。在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：特异性检测包含Y和Y’序列的延伸序列的检测试剂。在另一优选例中，所述的特异性检测包含Y和Y’序列的延伸序列的检测试剂是荧光定量PCR检测试剂；较佳地，所述的荧光定量PCR检测试剂包括：特异性扩增所述包含Y和Y’序列的延伸序列的正向引物、反向引物和特异性荧光探针。在本专利技术的另一方面，提供所述的试剂盒的用途，用于体外非诊断性地检测病源细胞。在本专利技术的另一方面，提供一种体外非诊断性地检测病源细胞的方法，所述方法包括：(1)提供前面任一所述的试剂盒，将所述的靶向性分子、非特异性信号监测寡核苷酸探针Y’与待测样品共混，孵育；(2)孵育结束后收集细胞，分别从细胞上分离(如洗脱)所述的靶向性分子和非特异性信号监测寡核苷酸探针Y’；(3)以步骤(2)分离的靶向性分子为模板，进行PCR定量分析，获得定量分析结果1；以步骤(2)分离的非特异性信号监测寡核苷酸探针Y’为模板，进行PCR定量分析，获得定量分析结果2；(4)将步骤(3)获得的定量分析结果1的定量值减去定量分析结果2的定量值，获得待测样品中病源细胞的存在情况以及存在量。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、3mL健康人血样，分别掺入20和0个KB细胞，连接或未连接叶酸的寡聚核苷酸标记后，检测值的变化。具体实施方式本专利技术人经过深入的研究，揭示了一种对病源细胞进行靶向定量检测过程中，监测非特异性信号的方法。本专利技术的方法包括选用了一种寡核苷酸片段作为非特异性信号监测寡核苷酸探针，其长度和GC％与检测病源细胞的靶向性分子的寡核苷酸探针部分相似(差异≤30％)，可监测靶向性分子的寡核苷酸部分与细胞结合产生的非特异性信号。本专利技术的方法有效降低非特异性结合导致的干扰，提高了检测病源细胞的准确性。术语如本文所用，所述的“病源细胞”是指来自于病灶组织的细胞(固定于病灶组织或由病灶组织释放并游离存在于体液中)，该细胞表面上存在有特定分子(例如表面抗原或受体)，该特定分子为该种病源细胞所特有的，且能够被特定的结合分子(如抗体、配体)结合，该特定的结合分子即为特异性靶向病源细胞的结合分子。例如，叶酸可以识别和结合癌细胞表面的叶酸受体(folatereceptor)，抗Her2的单克隆抗体可以识别和结合于乳癌细胞表面的Her2抗原；LHRH多肽可以识别和结合前列腺癌细胞表面的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测病源细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：检测病源细胞的靶向性分子，结构为X‑Y；其中，X代表特异性靶向病源细胞的结合分子；Y代表寡核苷酸探针；“‑”代表X和Y之间的共价连接、偶联或偶合的关系；非特异性信号监测寡核苷酸探针Y’，Y’的序列长度和序列信息与Y相似，但与Y在序列信息上存在部分碱基的不同。

【技术特征摘要】
1.一种检测病源细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：检测病源细胞的靶向性分子，结构为X-Y；其中，X代表特异性靶向病源细胞的结合分子；Y代表寡核苷酸探针；“-”代表X和Y之间的共价连接、偶联或偶合的关系；非特异性信号监测寡核苷酸探针Y’，Y’的序列长度和序列信息与Y相似，但与Y在序列信息上存在部分碱基的不同。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，Y’与Y的序列长度差异≤30％；或Y’与Y的序列中GC％差异≤30％。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，Y或Y’的序列长度为10-150bp或10-150nt。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，X选自：特异性靶向病源细胞的抗体、配体、化学小分子或多肽。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的病源细胞是肿瘤细胞，X是叶酸或叶酸-半胱氨酸偶联物；更佳地，所述的肿瘤细胞是循环肿瘤细胞。6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：针对Y的延伸引物，该延伸引物序列结构如下：A-B；其中，A为随机序列，B序列与Y序列的其中一个末端的序列互补；和针对Y’的延伸引物，该延伸引物序列结构如下：A-B’；其中，A的定义如前，B’序列与Y’序列的其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨国华，吕娟，陈倩，徐景祥，
申请(专利权)人：格诺思博生物科技南通有限公司，上海格诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32