本发明专利技术涉及用于预测辅助受精中植入成功性的测定法和试剂盒。具体地，本发明专利技术涉及用于确定通过对雌性受试者卵母细胞进行辅助受精获得或将获得的多个胚胎各自的植入潜力的测定法，所述测定法包括测量每个卵母细胞所来源之卵泡中存在的卵泡液(follicular fluid，FF)中粒细胞集落刺激因子(G‑CSF)的水平，并从所测量的FF G‑CSF水平确定每个胚胎的植入潜力。本发明专利技术还涉及用于实施所述测定法的试剂盒。本发明专利技术还涉及用于辅助受精的方法。
【技术实现步骤摘要】
本申请是申请号为200780027637.8的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/EP2007/057430的中国国家阶段申请。
本专利技术涉及用于预测辅助受精中植入成功性的测定法和试剂盒。
技术介绍
辅助受精，例如体外受精(in vitro fertilization，IVF)或细胞质内精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)成功用于患有不育症的人患者已有三十年。尽管进行了广泛的研究，但是这仍然是一个困难且昂贵的操作，并且通常观察到每移植胚胎的植入率低(15-20％)。提供辅助受精服务的医院和私人机构基于所产生胚胎的特征进行卵母细胞受精后的选择。例如，选择可基于胚胎的形态(Guerif F et al.，2007，Hum Reprod22(7)：1973)或者基于胚胎产生可溶性HLA-G的情况(Fuzzi B，et al.，2002，Eur J Immunol.Feb；32(2)：311-5.)。这两种技术都要求胚胎的介入。为了增加妊娠的成功率，所移植胚胎的数目通常大于一个。在欧洲，通常移植两个胚胎到子宫腔内。在美国则更多，经常移植三个或四个胚胎。此策略的不利作用是增加了多胎妊娠数以及随后的相关产科疾病，例如早产和低出生率。另外，辅助受精是一个昂贵的过程，并且还可造成患者的精神创伤。手术过程需要收集用于辅助受精的卵，受精之后需要另外的手术将受精卵植入子宫。然后，接受者必须等待一段时间，然后才可确定妊娠是否已经建立。在一些情况下，尽管重复多次，仍可能无法建立妊娠，这些情况在经济和人力方面都给社会带来了巨大耗费。因此，希望提供可在受精之前指示卵母细胞植入潜力的测定法和试剂盒，使得成功植入胚胎的机会最大化，并允许低成功率指征以用于避免辅助受精的上述创伤和花费。附图说明图1.来自使用Biorad Luminex试剂盒检测FF G-CSF的Luminex实验的ROC曲线。针对FF-GCSF浓度的不同截断点，将真阳性率(灵敏度)作为假阳性率(100-特异性)的函数作图。ROC曲线上的每个点代表对应于特定判别阈值的灵敏度/特异性对。ROC曲线下方的面积是FF-G-CSF能在何种程度上区分两个主要诊断组(确定植入/未植入)的量度。线1：曲线下面积是0.82，表明在82％的时间里来自阳性组的随机选择个体的测试值大于来自阴性组的随机选择个体的测试值。线2：ROC曲线下面积是0.5，代表无效假设。图2.来自使用R&D Luminex试剂盒检测FF G-CSF的Luminex实验的ROC曲线。线3：曲线下面积是0.72，表明在72％的时间里来自阳性组的随机选择个体的测试值大于来自阴性组的随机选择个体的测试值。线4：ROC曲线下面积是0.5，代表无效假设。图3.显示获得自多个受试者的同一组胚胎的个体卵泡液中浓度的变异。每个柱显示在所产生之同一组胚胎中个体卵泡液相对于平均值的变异。
技术实现思路
本专利技术基于专利技术人的如下意外发现，即卵巢过度刺激(ovarian hyperstimulation)下提供多个卵母细胞的雌性受试者会表现出在每个卵母细胞所来源的卵泡之卵泡液(follicle fluid，FF)中存在的多种细胞因子和生长因子水平的变异。另外，本专利技术人发现在卵母细胞所来源之个体卵泡的卵泡液中存在的高水平粒细胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF)与由所述卵母细胞受精所得胚胎的高植入潜力之间存在高度相关性。此前从未证明，对于同一受试者，围绕每个卵母细胞的卵泡液可能在组成上发生变异，并且所述组成指示随后受精卵植入的成功性。此发现允许对获自单个患者的多个胚胎按照植入潜力进行排序。首次发现，使用卵母细胞平均受精率标志物(例如11-β HSD)之指标显示出临界受精潜力(borderline fertility potential)的患者可能会具有显示出高植入潜力的卵母细胞，尽管总体平均值较差；这为之前显示不孕的雌性提供了新的机会。另外，所述方法提供了在不干扰胚胎或卵母细胞的情况下对每个卵母细胞单个分级并由此对胚胎单个分级的可能性。本专利技术涉及用于确定通过对雌性受试者卵母细胞进行辅助受精获得或将获得的多个胚胎各自的植入潜力的测定法，所述测定法包括测量每个卵母细胞所来源的卵泡中存在的卵泡液中G-CSF水平，以及从所测量的卵泡液G-CSF水平确定每个胚胎的植入潜力。来自具有最高卵泡液G-CSF水平之卵泡的卵母细胞将得到具有最大植入潜力的胚胎。本专利技术涉及可用于预测雌性患者中辅助受精结果的检测试剂盒。本专利技术还涉及用于受精处理方法以改善植入的测定法和试剂盒。本专利技术的一个实施方案是用于确定雌性受试者通过辅助受精获得或将获得的胚胎的植入潜力的测定法，其包括：(i)针对收集自所述受试者的多个卵母细胞，测量每个所收集卵母细胞的卵泡的卵泡液中存在的卵泡液粒细胞集落刺激因子(G-CSF)水平；和(ii)从所测量的FF G-CSF水平确定通过所述卵母细胞的辅助受精获得或将获得的胚胎的植入潜力。本专利技术的另一个实施方案是如上所述的测定法，其中具有最高FF G-CSF水平的卵母细胞具有最高的植入潜力。本专利技术的另一个实施方案是如上所述的测定法，其中每个FF样品获得自卵泡吸出物。本专利技术的另一个实施方案是如上所述的测定法，其中在收集卵泡吸出物的20小时内测量各自的FF G-CSF水平。本专利技术的另一个实施方案是如上所述的测定法，其中FF-CSF水平等于或小于20.6pg/ml确定为没有植入潜力或具有低植入潜力。本专利技术的另一个实施方案是如上所述的测定法，其中FF-CSF水平等于或大于24.0pg/ml确定为具有高植入潜力。本专利技术的另一个实施方案是如上所述的测定法，其中使用免疫测定法测量各自的FF G-CSF水平。本专利技术的另一个实施方案是如上所述的测定法，其中使用竞争性或免疫测量测定法如RIA、IRMA、ELISA或ELISPOT测定来测量各自的FF G-CSF水平。本专利技术的另一个实施方案是如上所述的测定法，其中使用Luminex测定来测量各自的FF G-CSF水平。本专利技术的另一个实施方案是如上所述的测定法，其中所述Luminex测定使用Biorad或者R&D Luminex试剂盒。本专利技术的另一个实施方案是如上所述的测定法，其中通过测定FF G-CSF mRNA水平测量各自的FF G-CSF水平。本专利技术的另一个实施方案是如上所述的测定法，其中通过表面等离子共振、荧光共振能量转移、生物发光共振能量转移、荧光淬灭荧光、荧光偏振法、MS、HPLC、HPLC/SM、HPLC/MS/MS、毛细管电泳、柱凝胶电泳或板式凝胶电泳中的任意方法来测量各自的FF G-CSF水平。本专利技术的另一个实施方案是用于实施如上所述测定的试剂盒，其包含适于检测FF G-CSF或FF G-CSF mRNA水平的至少一种试剂。本专利技术的另一个实施方案是如上所述的试剂盒，其还包含一组FF G-CSF的浓度标准品。本专利技术的另一个实施方案是如上所述的试剂盒，其还包含用于从受试者提取卵母细胞和卵泡液的多个吸取器尖端(aspirator tips)。本专利技术的另一个实施本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于确定通过卵母细胞的辅助受精获得或将获得的胚胎的植入潜力的测定法，其包括：(i)针对收集自雌性受试者的多个卵母细胞测量每个所收集卵母细胞的卵泡的卵泡液(FF)中存在的FF粒细胞集落刺激因子(G‑CSF)的水平；和(ii)从所测量的FF G‑CSF水平确定通过所述卵母细胞的辅助受精获得或将获得的每个胚胎的植入潜力。
【技术特征摘要】
2006.07.21 US 60/832,0941.一种用于确定通过卵母细胞的辅助受精获得或将获得的胚胎的植入潜力的测定法，其包括：(i)针对收集自雌性受试者的多个卵母细胞测量每个所收集卵母细胞的卵泡的卵泡液(FF)中存在的FF粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的水平；和(ii)从所测量的FF G-CSF水平确定通过所述卵母细胞的辅助受精获得或将获得的每个胚胎的植入潜力。2.至少一种适于检测FF G-CSF或FF G-CSF mRNA水平的试剂在制备用于针对收集自受试者的多个卵母细胞测量每个所收集卵母细胞的卵泡的FF中存在的FF G-CSF的水平的试剂盒或诊断剂中的用途，其中从所测量的FF G-CSF水平确定通过所述卵母细胞的辅助受精获得或将获得的每个胚胎的植入潜力。3.至少一种适于检测FF G-CSF或FF G-CSF mRNA水平的试剂在制备用于针对收集自受试者的多个卵母细胞确定通过所述卵母细胞的辅助受精获得或将获得的每个胚胎的植入潜力的试剂盒或检测剂中的用途，其中测量每个所收集卵母细胞的卵泡的FF中存在的FF G-CSF的水平，从所测量的FF G-CSF水平确定每个胚胎的植入潜力。4.用于确定雌性受试者通过辅助受精获得或将获得的胚胎的植入潜力的试剂盒，其包括：用于针对收集自所述受试者的多个卵母细胞测量每个所收集卵母细胞的卵泡的FF中存在的FF G-CSF的水平的系统，其中所述系统包含至少一种适于检测FF G-CSF或FF G-CSF mRNA水平的试剂。5.根据前述权利要求中任一项所述的测定法或用途或试剂盒，其中具有最高FF G-CSF水平的卵母细胞具有最高的植入潜力。6.根据前述权利要求中任一项所述的测定法或用途或试剂盒，其中每个FF样品获得自卵泡吸出物。7.根据前述权利要求中任一项所述的测定法或用途或试剂盒，其中在卵泡吸出物收集的20小时内测量各自的FF G-CSF水平。8.根据前述权利要求中任一项所述的测...
【专利技术属性】
技术研发人员：纳塔莉·莱德，马里皮埃尔·皮钦尼，拉乌尔·隆布罗索，
申请(专利权)人：费马龙公司，
类型：发明
国别省市：比利时;BE
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