一种提取木本植物花粉管核蛋白的方法及其试剂盒技术

本发明专利技术提供一种提取木本植物花粉管核蛋白的方法及其试剂盒。所述试剂盒中包括试剂A、试剂B和试剂C；所述试剂A中含有纤维素酶和离析酶，所述试剂B中含有Hepes、NaCl、MgCl

【技术实现步骤摘要】
一种提取木本植物花粉管核蛋白的方法及其试剂盒
本专利技术涉及植物生物
，具体地说，涉及一种提取木本植物花粉管核蛋白的方法及其试剂盒。
技术介绍
细胞核蛋白是亚细胞蛋白质的一部分，提取获得纯净的细胞核蛋白对于研究蛋白的性质、表达及信号转导过程都具有重要的意义。核蛋白的提取是研究功能基因的转录调控及信号转导的基础。目前对于植物核蛋白的提取已有报道，但适用于木本植物花粉管核蛋白提取的方法较少。由于花粉管存在材料收集及研磨效率低的问题，同时木本植物的细胞壁组成成分也较为复杂，因此对于花粉管中的转录因子的研究更为困难。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一套用于提取木本植物花粉管核蛋白的试剂组合及其试剂盒。本专利技术的另一目的是提供一种提取木本植物花粉管核蛋白的方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供一套用于提取木本植物花粉管核蛋白的试剂组合，包括试剂A、试剂B和试剂C；所述试剂A中含有纤维素酶和离析酶，所述试剂B中含有Hepes、NaCl、MgCl2、NaF、PMSF(苯甲基磺酰氟)和DTT(二硫苏糖醇)，所述试剂C中含有丙三醇、TritonX-100、DTT和PMSF。其中，所述试剂A中纤维素酶和离析酶的质量百分含量分别为0.4-0.6％(优选0.5％)和1％，pH值为6.5-7.0(优选pH6.8)，以水配制。所述纤维素酶和离析酶优选为纤维素酶R10和离析酶R10。所述试剂B中Hepes、NaCl、MgCl2、NaF、PMSF和DTT的浓度分别为20-30mM、80-120mM、10-20mM、10-20mM、1-3mM和10-20mM，以水配制。优选地，试剂B中Hepes、NaCl、MgCl2、NaF、PMSF和DTT的浓度分别为25mM、100mM、15mM、10mM、1mM和10mM。所述试剂C中丙三醇和TritonX-100的质量百分含量分别为15-25％和1-2％，DTT和PMSF的浓度分别为2-5mM和0.5-1.5mM，以水配制。优选地，试剂C中丙三醇和TritonX-100的质量百分含量分别为20％和1.5％，DTT和PMSF的浓度分别为3mM和1mM。本专利技术还提供一种用于提取木本植物花粉管核蛋白的试剂盒，所述试剂盒包含上述试剂组合。本专利技术进一步提供一种利用上述试剂盒提取木本植物花粉管核蛋白的方法，包括以下步骤：1)花粉管体外萌发，用试剂A酶解花粉管，得到酶解产物；2)用尼龙网过滤所述酶解产物，弃滤液，收集花粉管原生质体；3)用试剂B裂解花粉管原生质体，获得花粉管原生质体粗蛋白；4)滤纸过滤粗蛋白，离心收集细胞核；5)用试剂C裂解细胞核，离心收集的上清液中含有木本植物花粉管核蛋白。前述的方法，步骤1)中待花粉管体外萌发至长度15-20μm，进行酶解。酶解条件为：37℃避光酶解2-4h。试剂A的用量为500-1000μl/200mg花粉管(优选约800μl/200mg花粉管)。前述的方法，步骤2)中收集花粉管原生质体后，还包括将原生质体从尼龙网上冲洗下来，并100-250rpm离心10-20min(优选200rpm离心15min)，收集花粉管原生质体沉淀的步骤。优选地，将尼龙网置于漏斗中，收集花粉管原生质体。前述的方法，步骤3)中裂解条件为：冰上裂解0.5-1.5h(优选1h)。试剂B的用量为3-5ml(优选4ml)。前述的方法，步骤4)滤纸过滤粗蛋白，然后4℃，1500g离心15min，收集细胞核沉淀。前述的方法，步骤5)具体操作如下：向离心收集得到的细胞核沉淀中加入试剂C，置于冰上0.5-1.5h(优选1h)，期间不断摇晃，使得细胞核充分裂解，然后4℃，1500g离心20min，收集上清液。其中，试剂C的用量为3-5ml(优选3ml)。本专利技术中，所述木本植物包括苹果。苹果花粉管核蛋白MdMYC2的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术具有以下优点：本专利技术提供了一种用于木本植物花粉管核蛋白提取的方法及其试剂盒。可实现快速、灵敏、准确性高、简便地提取木本植物材料花粉管中的核蛋白。本专利技术以苹果花粉管为试材，通过收集、酶解花粉管壁后，进行核蛋白提取。采用本专利技术的方法可以提取大量、相对纯净的花粉管核蛋白，为直观鉴定木本植物花粉管内核蛋白的表达及定量提供技术体系。附图说明图1为本专利技术实施例1中提取的花粉管粗蛋白和核蛋白进行Westernblot检测的结果。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。本专利技术试剂中各组分浓度如无特殊说明，均指终浓度。以下实施例中纤维素酶R10：5U/mg；离析酶R10：5U/mg。纤维素酶R10酶活定义：1g酶粉(或1ml酶液)在50℃、pH4.8条件下，1min水解底物(滤纸、CMC、脱脂棉或水杨素)产生1μg葡萄糖的酶量为1个酶活力单位。离析酶R10酶活定义：1g酶粉(或1ml酶液)在50℃、pH3.5条件下，1h分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为1个酶活力单位。纤维素酶R10(目录号为110921-01)、离析酶R10(目录号为202050)购于YakultHonsha，其他常规生化试剂购自北京经科宏达生物技术公司和北京欣经科生物技术公司。离心管等一般耗材购于Axygen公司。实施例1提取苹果花粉管核蛋白的方法由于本专利技术人前期克隆获得了一个苹果‘国光’花粉管中的转录因子，并经原核表达获得抗原，制备了兔抗原的特异性抗体，为方便后续研究，选择‘国光’花粉为研究对象。提取苹果花粉管核蛋白方法的流程为：萌发培养—酶解—原生质体收集—粗蛋白提取—收集细胞核—裂解核蛋白，因此分别从以上各个步骤设计实验来确定提取苹果花粉管核蛋白的最佳体系。一、苹果花粉管核蛋白的提取1、苹果花粉管的萌发将苹果花粉分散于液体培养基表面，水合15min后，置于23℃培养箱中暗培30min进行萌发培养，期间利用体式显微镜观察花粉管的长度，待花粉管长度长至15-20μm，可停止萌发培养。2、酶解本实施例所用酶溶液为试剂A，由纤维素酶、离析酶组成，所述纤维素酶、所述离析酶的配比为0.5％纤维素酶(质量百分含量)：1％离析酶(质量百分含量)。以水配制。将上述试剂A取出适量，55℃加热10min，置于冰上，待用。收集萌发后的花粉管约200mg，于4℃200g低速离心，弃上清，收集淡黄色花粉管。向沉淀中加入上述酶溶液(试剂A)800μl，37℃酶解2-4h，避光。3、花粉管原生质体收集将直径为50μm的过滤尼龙网置于漏斗中，将上述酶解产物加入到尼龙网中，原生质体过滤到尼龙网上，得到含有原生质体的尼龙网。将原生质体从尼龙网中冲洗下来，并低速离心，所述离心的时间为15min，200rpm。4、花粉管原生质体粗蛋白提取向收集花粉管原生质体的沉淀约200mg中加入4ml试剂B，置于冰上充分裂解1h，期间不断颠倒混匀，涡旋震荡数次，以保证细胞充分裂解。所述试剂B的配方为：Hepes、NaCl、MgCl2、NaF、PMSF和DTT，浓度分别为25mM、100mM、15mM、10mM、1mM和10mM，以水配制。5、细胞核收集将滤纸置于漏斗中，将上述粗蛋白提取液滴入滤纸中心，以取出大块植物组织和花粉粒。收集滤液，本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于提取木本植物花粉管核蛋白的试剂组合，其特征在于，包括试剂A、试剂B和试剂C；所述试剂A中含有纤维素酶和离析酶，所述试剂B中含有Hepes、NaCl、MgCl

【技术特征摘要】
1.用于提取木本植物花粉管核蛋白的试剂组合，其特征在于，包括试剂A、试剂B和试剂C；所述试剂A中含有纤维素酶和离析酶，所述试剂B中含有Hepes、NaCl、MgCl2、NaF、PMSF和DTT，所述试剂C中含有丙三醇、TritonX-100、DTT和PMSF；其中，所述木本植物包括苹果。2.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述试剂A中纤维素酶和离析酶的质量百分含量分别为0.4-0.6％和1％，pH值为6.5-7.0，以水配制；所述纤维素酶和离析酶分别为纤维素酶R10和离析酶R10。3.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述试剂B中Hepes、NaCl、MgCl2、NaF、PMSF和DTT的浓度分别为20-30mM、80-120mM、10-20mM、10-20mM、1-3mM和10-20mM，以水配制。4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂组合，其特征在于，所述试剂C中丙三醇和TritonX-100的质量百分含量分别为15-25％和1-2％，DTT和PMSF的浓度分别为2-5mM和0.5-1.5mM，以水配制。5.用于提取木本植物花粉管核蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-4任一项所述试剂组合。6.利用权利要求5所述试剂盒提取木本植...

【专利技术属性】
技术研发人员：李天忠，顾钊宇，李威，杨清，李洋，于杰，刘春生，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11