一种用于提取植物RNA的试剂盒以及提取方法技术

本发明专利技术公开了一种用于提取植物RNA的试剂盒以及提取方法。本发明专利技术用于提取植物RNA的试剂盒包括：溶液A：1～2％SDS、10～100mM EDTA(pH 8.0)、0.1～1M Tris‑HCl(pH 7.0～8.0)、0.5～2M NaCl和1～10％β‑巯基乙醇；溶液B：3～7M KAC；溶液C：水饱和酚(pH 4.5)；溶液D：体积比为24：1的氯仿和异戊醇；溶液E：异丙醇。本发明专利技术用于提取植物RNA的试剂盒可以高效提取得到纯度高且完整性好的植物RNA，是分子生物学的多项实验研究的关键前提，具有良好的应用前景和实用价值。本发明专利技术还公开了一种使用上述试剂盒提取RNA的方法。

Kit for extracting plant RNA and extraction method

The invention discloses a kit for extracting plant RNA and an extraction method thereof. The invention is used for extracting plant RNA kit includes: solution of A:1 ~ 2%SDS, 10 ~ 100mM EDTA (pH 8), 0.1 - 1M Tris HCl (pH 7 ~ 8), 0.5 ~ NaCl and 1 ~ 10% 2M beta mercaptoethanol solution; B:3 ~ 7M KAC solution; C: water saturated phenol (pH 4.5); D solution: the volume ratio of 24:1 chloroform isoamyl alcohol and isopropanol solution: E. The present invention kit for extracting plant RNA can be efficiently extracted from plant RNA has high purity and integrity, is a key prerequisite for a number of experimental studies of molecular biology, has a good application prospect and practical value. The invention also discloses a method for extracting RNA by using the reagent kit.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，更具体地说，本专利技术涉及一种可以从植物中分离到纯度高且完整性好的RNA的试剂盒以及相应的提取方法。
技术介绍
在进行植物基因克隆、Northern杂交分析、cDNA文库构建、RT-PCR和RealtimePCR等分子生物学的研究中，需要得到完整的RNA；近年兴起的高通量测序，对RNA的质量和浓度要求更高，高通量测序的RNA浓度要求大于200ng/uL，总量大于15ug。从植物中分离到纯度高且完整性好的RNA，是顺利进行上述的实验关键。铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)是兰科石斛属多年附生草本植物。由于其水溶性多糖含量较高，从中提取RNA非常困难。这是因为植物组织中水溶性多糖的理化性质与RNA相似，溶于水而不溶于有机溶剂(无水乙醇、异丙醇)，很难将它们分开。另外多糖可以还能抑制许多酶的活性，污染了水溶性多糖的RNA样品无法用于进一步的分子生物学研究。另外，由于富含多酚类的植物，在植物组织受到破坏后，就会释放出大量的酚，酚被氧化而形成褐色醌类物质能与RNA稳定结合，很难分离；淀粉也是一类降低RNA质量和产量的物质。所以很难从富含水溶性多糖、多酚和淀粉的植物材料中分离提取到高纯度、高浓度完整的RNA。目前针对富含水溶性多糖、多酚和淀粉的植物的RNA提取方法和RNA提取试剂盒的效果均不理想，有人通过CTAB法针对富含水溶性多糖多酚的植物进行RNA提取，但存在RNA降解的问题，提取效率低；还有人使用改良版SDS法对植物进行RNA提取，经实验，提取过程中溶液会粘稠成团，无法摇匀，无法进行下一步实验；还有人使用天泽RNAOut2.0进行RNA提取，在水溶性多糖含量低于20％时可以提取到RNA，但效率较低，只能满足一些常规实验，无法满足高通量测序的需求；当水溶性多糖含量更高时，水溶性多糖会与RNA缠绕在一起堵住滤膜，无法洗脱。还有使用低浓度乙醇处理、氯化锂沉淀法等来去除水溶性多糖，但均会使RNA提取效率大大降低。有鉴于此，确有必要提供一种可以从植物中分离到纯度高且完整性好的RNA的试剂盒以及相应的提取方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：克服现有植物RNA提取中，当植物水溶性多糖、多酚、蛋白质含量较高时出现的影响RNA提取效率等问题，提供一种可以从植物中分离到纯度高且完整性好的RNA的试剂盒以及相应的提取方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了一种用于提取植物RNA的试剂盒，包括：溶液A：1～2％SDS、10～100mMEDTA(pH8.0)、0.1～1MTris-HCl(pH7.0～8.0)、0.5～2MNaCl和1～10％β-巯基乙醇；溶液B：3～7MKAC；溶液C：水饱和酚；溶液D：体积比为24：1的氯仿和异戊醇；溶液E：异丙醇。作为本专利技术用于提取植物RNA的试剂盒的一种改进，所述试剂盒还包括溶液F，其中，所述溶液F为含有75％乙醇，用于对RNA沉淀进行洗涤。作为本专利技术用于提取植物RNA的试剂盒的一种改进，所述植物为富含水溶性多糖、富含多酚和/或富含淀粉类的植物。作为本专利技术用于提取植物RNA的试剂盒的一种改进，所述植物为铁皮石斛、菠萝蜜叶片或水稻种子。为了实现上述专利技术目的，本专利技术还提供了一种使用上述试剂盒提取植物RNA的方法，包括如下步骤：(1)粉碎植物样品；(2)加入权利要求1中所述溶液A、溶液B、溶液C和溶液D，将植物样品的细胞壁裂解并去除植物样品中的水溶性多糖、多酚和淀粉；(3)加入权利要求1中所述溶液E，将步骤(2)所得中间产物进行沉淀，得到植物RNA。当所述提取植物RNA的试剂盒中含有溶液F时，所述植物RNA的提取方法包括如下步骤：(1)粉碎植物样品；(2)加入权利要求1中所述溶液A、溶液B、溶液C和溶液D，将植物样品的细胞壁裂解并去除植物样品中的水溶性多糖、多酚和蛋白质；(3)加入权利要求1中所述溶液E和溶液F，将步骤(2)所得中间产物进行沉淀，得到植物RNA。作为本专利技术植物RNA的提取方法的一种改进，步骤(1)中，所述粉碎植物样品是在液氮中将植物样品研磨成粉末。作为本专利技术植物RNA的提取方法的一种改进，所述植物样品为富含水溶性多糖、富含多酚和/或富含淀粉类的植物。作为本专利技术植物RNA的提取方法的一种改进，所述植物样品为铁皮石斛、菠萝蜜叶片或水稻种子。与现有技术相比，本专利技术用于提取植物RNA的试剂盒及相应的RNA提取方法具有如下优点：1)本专利技术实验步骤少，操作简单，可大大缩短实验时间，缩短时间可有效防止RNA降解，减少操作步骤可最大限度减少RNA在操作过程中的损失；2)本专利技术用于提取植物RNA的试剂盒适用于各种植物，特别适用于富含水溶性多糖、多酚和/或淀粉量高的植物，提取得到的RNA不仅浓度高、纯度高，而且完整性也好，可用于高要求的生物学实验和高通量测序；3)本专利技术用于提取植物RNA的试剂盒中所用药品为一般实验药品，对人体无害，对环境友好。附图说明下面结合附图和具体实施方式，对本专利技术用于提取植物RNA的试剂盒及提取方法及其有益效果进行详细说明。图1为铁皮石斛茎中的水溶性多糖百分含量，其中，Stage1表示生长期为10个月的铁皮石斛茎中的水溶性多糖百分含量，Stage2表示生长期为12个月的铁皮石斛茎中的水溶性多糖百分含量。图2为实施例1中的铁皮石斛的RNA电泳图，其中，1表示生长期为10个月的铁皮石斛茎的RNA，2表示生长期为12个月的铁皮石斛茎的RNA。图3为Agilent2100检测生长期为10个月的铁皮石斛茎的RNA。图4为Agilent2100检测生长期为12个月的铁皮石斛茎的RNA。图5为实施例2中的菠萝蜜叶片的RNA电泳图。图6为实施例3中的水稻种子的RNA电泳图。具体实施方式为了使本专利技术的专利技术目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本专利技术，并非为了限定本专利技术，实施例的配方、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。以下实施例中使用本专利技术植物RNA提取试剂盒可采用如下操作步骤：(1)取0.1g的植物材料于研钵中，液氮充分研磨成粉末，装入1.5mL的离心管中，加入800～1000uL的SolutionA，充分混匀。65℃金属浴15～20min，每3～5min摇匀一次。13000rpm离心5min。(2)取上清于1.5mL的离心管中，加入0～1/2体积的SolutionB，充分混匀。-20℃放置10min；4℃、13000rpm离心10min。(若水溶性多糖含量低于20％，可以省略)(3)取上清液，加入1/2体积的SolutionC，充分混匀，-20℃放置5min；4℃、13000rpm离心10min。(4)取上清于2mL的离心管中，加入等体积的SolutionD，充分混匀，4℃、13000rpm离心10min。(5)取上清，加入等体积的SolutionE，-20℃放置10min；4℃、13000rpm离心15min。(6)弃上清，用SolutionF洗涤沉淀2次，离心，用枪头尽可能去残液，室温放置3min，使残留的酒精挥发，加入30～80uL的DEPCH2O，取2uL电泳检测或进行其他的质量检测。实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于提取植物RNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：溶液A：1～2％SDS、10～100mM EDTA(pH 8.0)、0.1～1M Tris‑HCl(pH 7.0～8.0)、0.5～2M NaCl和1～10％β‑巯基乙醇；溶液B：3～7M KAC；溶液C：水饱和酚；溶液D：体积比为24：1的氯仿和异戊醇；溶液E：异丙醇。

【技术特征摘要】
1.一种用于提取植物RNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：溶液A：1～2％SDS、10～100mMEDTA(pH8.0)、0.1～1MTris-HCl(pH7.0～8.0)、0.5～2MNaCl和1～10％β-巯基乙醇；溶液B：3～7MKAC；溶液C：水饱和酚；溶液D：体积比为24：1的氯仿和异戊醇；溶液E：异丙醇。2.根据权利要求1所述的用于提取植物RNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括溶液F，其中，所述溶液F为含有75％乙醇。3.根据权利要求1或2所述的用于提取植物RNA的试剂盒，其特征在于，所述植物为富含水溶性多糖、富含多酚和/或富含淀粉类的植物。4.根据权利要求3所述的用于提取植物RNA的试剂盒，其特征在于，所述植物为铁皮石斛、菠萝蜜叶片或水稻种子。5.一种植物RNA的提取方法，其特征在于，所述提取方法是使用权利要求1所述用于提取植物RNA的试剂盒进行提取，包括如下步骤：(1)粉碎植物样品；(2)加入权利要求1中所述溶液A、溶液B、溶液C...

【专利技术属性】
技术研发人员：段俊，何春梅，张建霞，
申请(专利权)人：中国科学院华南植物园，
类型：发明
国别省市：广东;44