一种清热复方治疗大鼠肝肺热休克蛋白基因的方法技术

一种清热复方治疗大鼠肝肺热休克蛋白基因的方法，采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)对热休克模型组、内毒素模型组和正常对照组大鼠的肝、肺组织进行了HSP70 mRNA表达的检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种清热复方治疗大鼠肝肺热休克蛋白基因的方法，具体地说是一种清热复方治疗大鼠肝肺热休克蛋白基因的方法。
技术介绍
目前公知的热休克蛋白(heatshockproteins,HSPs)。整体动物的热处理可预防随后的心、脑、肺、视网膜等损伤，认为全身热处理对这些器官的保护作用与HSPs的表达有关。HSPs作为分子伴侣，在维持细胞的正常形态及功能中起着重要作用，参与其他蛋白质的折叠、转运、合成等过程，与细胞内的其他肽类蛋白质结合，参与细胞的抗损伤、修复和热耐受过程，其在多种疾病过程中的重要作用已经被大量证据证实。一切生物在受到高温、缺氧、感染、创伤及乙醇等因素的刺激时，会发生细胞应答反应，其共同特点是产生一组具有生物活性的蛋白――热休克蛋白。HSPs是一组高度保守的伴随细胞蛋白，可使细胞非特异性抗损伤能力增加，能对抗更为严重的应激损伤。HSPs与一些基本的细胞功能有关，如蛋白转运、折叠和装配，是存在于细胞内的一种主要“分子伴侣”，在维持组织细胞的自身稳定和环境适应性方面有重要作用，对细胞抗御损伤有保护作用。
技术实现思路
1.材料与方法A.研究对象；清洁级健康雄性SD大鼠70只，体重(200±10)g。B.药物与试剂；药物：白虎汤(石膏30g、粳米9g、知母9g、甘草3g)，每剂水煎浓缩至50mL，相当于生药1g/mL；黄连解毒汤(黄连9g、黄芩6g、黄柏6g、栀子9g)，每剂水煎浓缩至30mL，相当于生药1g/mL，4℃保存备用。主要试剂：总RNA提取试剂盒和逆转录PCR反应试剂盒；RTＰＣＲ引物(Canada,StressGenCorp,STM507);βaction引物；DL2000DNAMarker。主要仪器；ＴＧＬ16G型台式高速冷冻离心机；DNA／RNA纯度检测仪(GeneQuantAmericanPharmaciaBiotechCorp)；PE9600型PCR扩增仪(AmericanPerkinCorp)；EDAS120电泳凝胶图象分析系统(AmericanKodakCorp)。C.动物分组及处理；70只雄性SD大鼠随机分为热休克模型组、热休克加白虎汤组、热休克加黄连解毒汤组、内毒素模型组、内毒素加白虎汤组、内毒素加黄连解毒汤组、正常对照组7组，每组10只。热休克组大鼠模型的制备与处理；将大鼠按不同组别分别用生理盐水、白虎汤、黄连解毒汤灌胃(100g/kg)，1h后进行第2次灌胃，再经1h将大鼠置恒温烤箱中进行热休克处理，参考Cruiie方法，温度控制在约55℃，测量大鼠肛温达到42℃，维持10～15min，密切观察大鼠动态，大鼠出现烦躁、乱窜动、毛发竖立、爪底湿润后，断头处死，取肺、肝组织备用。D.内毒素组大鼠模型的制备与处理；将大鼠按不同组别分别用生理盐水、白虎汤、黄连解毒汤灌胃(100g/kg),1h后于尾静脉注射内毒素(15mg/kg)，1h后再重复灌胃，3h后观察大鼠出现烦躁、乱窜动后，断头处死，取肺、肝组织备用。正常对照组生理盐水灌胃，不经其他任何处理，断头处死，取其肝、肺组织备用。E.实验方法；采用ＲＴＰＣＲ法检测各组大鼠肝、肺组织中HSP70mRNA的表达。βaction引物序列：SensePrimer5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′；AntisensePrimer5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′。HSP70引物序列：SensePrimer5′CTCCAGCATCCGACAAGAAGC3′；AntisensePrimer5′ACGGTGTTGTGGGGGTTCAGG3′。action扩增片段长度为450个碱基对(basepair,bp)，HSP70扩增片段长度为234bp。ＲＴＰＣＲ反应体系组成：MgCl２60μL，10×ＲＮＡＰＣＲＢuffer80μL,TaKaRaLATaq05μL，HSP70上下游引物各1μL，βaction上下游引物各1μL，RnaseFreedH2O615μL，总反应体积为80μL。PCR扩增反应条件为：前预变性94℃2min，1个循环；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共28个循环；后延伸15min。取出反应液约10μL，在2%琼脂糖凝胶上电泳，溴乙锭染色，将电泳结果置于EDAS120电泳凝胶图象分析系统内扫描并摄片。采用Gelbase电脑软件对HSP70DNA与βactionDNA条带进行光密度扫描，计算HSP70DNA和βactionDNA吸收峰面积之比，即Ｄ值，以此估计HSP70mRNA的表达情况。统计学处理；用SPSS100软件进行多组间两两比较。2.结果；各组大鼠肝、肺组织中HSP70mRNA转录水平的比较结果，热休克各组与内毒素各组大鼠的肝、肺组织中HSP70mRNA表达不同，热休克各组HSP70mRNA表达均比正常对照组高（均Ｐ＜００５），而内毒素各组的表达与正常对照组相比均无显著性差异（Ｐ＞００５）。说明热刺激(热休克)比致热源更容易刺激细胞组织合成热休克蛋白，从而增加对组织细胞的耐热性和保护作用。热休克加白虎汤组及热休克加黄连解毒汤组的HSP70mRNA的表达高于热休克模型组（Ｐ＜００５）；热休克加黄连解毒汤组大鼠在肝、肺组织中HSP70的表达与热休克加白虎汤组相比有显著性差异（Ｐ＜００５）。表明白虎汤和黄连解毒汤均能诱导HSP70表达的增加，从而增强对肝、肺组织的保护作用。相比之下，白虎汤较黄连解毒汤在肝、肺组织中更能诱导HSP70的表达。中药清热复方亦不能诱导内毒素模型组中HSP70表达的增多，提示内毒素导致的炎性发热不能刺激组织细胞合成对细胞有保护作用的HSP70。专利技术目的：生物体在高温或其他因素刺激下会诱导基因开放而合成一组新的蛋白质―热休克蛋白(heatshockproteins,HSPs)。许多研究证实整体动物的热处理可预防随后的心、脑、肺、视网膜等损伤，并认为全身热处理对这些器官的保护作用与HSPs的表达有关。HSPs作为分子伴侣，在维持细胞的正常形态及功能中起着重要作用，参与其他蛋白质的折叠、转运、合成等过程，与细胞内的其他肽类蛋白质结合，参与细胞的抗损伤、修复和热耐受过程，其在多种疾病过程中的重要作用已经被大量证据证实。本研究主要采用逆转录聚合酶链反应(ＲＴＰＣＲ）观察白虎汤和黄连解毒汤对热休克、内毒素两种大鼠热证模型的HSP70基因表达的调控，以探讨清热解毒中药对HSP70表达的影响。技术方案：方法将70只大鼠随机分为热休克模型组、热休克加白虎汤组、热休克加黄连解毒汤组、内毒素模型组、内毒素加白虎汤组、内毒素加黄连解毒汤组和正常对照组7组，每组10只。采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)对热休克模型组、内毒素模型组和正常对照组大鼠的肝、肺组织进行了HSP70mRNA表达的检测，观察清热复方白虎汤和黄连解毒汤分别对两种模型大鼠肝、肺组织HSP70mRNA表达的影响。专利技术有益效果：热休克模型组、热休克加白虎汤组和热休克加黄连解毒汤组中HSP70mRNA的表达高于正常对照组（Ｐ＜００５）；热休克加白虎汤组和热休克加黄连解毒汤组均高于热休克模型组（Ｐ＜００５）；内毒素模型组、内毒素加白虎汤组和内毒素加黄连解毒汤组之间的HSP70mRNA表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种清热复方治疗大鼠肝肺热休克蛋白基因的方法，采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)对热休克模型组、内毒素模型组和正常对照组大鼠的肝、肺组织进行了HSP70 mRNA表达的检测，观察清热复方白虎汤(石膏30g、粳米9g、知母9g、甘草3g每剂水煎浓缩至50mL，相当于生药1g/mL；)和黄连解毒汤(黄连9g、黄芩6g、黄柏6g、栀子9g每剂水煎浓缩至30mL，相当于生药1g/mL；)分别对两种模型大鼠肝、肺组织HSP70 mRNA表达的影响。

【技术特征摘要】
1.一种清热复方治疗大鼠肝肺热休克蛋白基因的方法，采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)对热休克模型组、内毒素模型组和正常对照组大鼠的肝、肺组织进行了HSP70mRNA表达的检测，观察清热复方白虎汤(石膏30g、粳米9g、知母...

【专利技术属性】
技术研发人员：白建学，
申请(专利权)人：白建学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62