一种基于Mmc LppA蛋白的间接ELISA试剂盒及使用方法技术

本发明专利技术公开了一种基于Mmc LppA 蛋白的间接ELISA试剂盒及使用方法。基于Mmc LppA蛋白的间接ELISA试剂盒原料及配方为：包被Mmc LppA 蛋白的酶标板、Mmc标准阳性和标准阴性血清、酶标二抗、50×PBST缓冲液、封闭缓冲液、底物液A、底物液B和终止液。本发明专利技术能检测羊血清Mmc感染抗体和疫苗免疫抗体，将为Mmc引起的山羊和绵羊支原体型肺炎的早期监测、疫苗免疫效果评价及相关研究工作提供关键技术，对本病原所致疫病的早发现早防控具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基于MmcLppA蛋白的间接ELISA试剂盒及使用方法。
技术介绍
丝状支原体山羊亚种Mmc是致山羊和绵羊发生慢性呼吸道传染疾病及影响养羊业发展的重要疫病的主要病原菌之一，所致传染性胸膜肺炎潜伏期平均为18~20d，最短的是3~6d，最长可达到30~40d。其临床症状表现主要为体温升高、萎靡呆立、食欲减退、呼吸困难且痛苦呻吟。带菌羊和病羊是该病的主要传染源，该病主要是在接触传播和呼吸道，病死率较高（EnginBalikci，2008；田青，2006）。1971年Carmicheal分离到具有致病性新型支原体，且命名为丝状支原体山羊亚种，相继在许多国家如叙利亚、印度、苏丹和肯尼亚等地发现该病原。我国于在内蒙古曾经流行该病（CarmichaelLE,1972；邹联斌，2007）。丝状支原体山羊亚种引发的早期支原体肺炎病例长时间以来未曾引起人们的重视，但近年调查发现，该病死亡率呈不断上升趋势，给养羊业带来严重的经济损失(张双翔，2013)。对丝状支原体山羊亚种的防控，目前主要依靠药物预防，也可使用疫苗，但防控成本很高，究其原因与Mmc分离培养费时费力有关（候相山等，2006；赵萍等，2008）。临床疫苗应用后，目前缺乏疫病检测与防控所需的快速血清学检测手段，尤其可高通量检测、敏感性高的ELISA方法，缺乏有效的免疫防控效果评估，给养羊业带来严重的经济损失（张双翔，2012）。构建含MmcLppA蛋白C末端基因的原核表达载体，建立基于表达产物MmcLppA蛋白的间接ELISA技术十分必要和紧迫。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于，选取核苷酸同源性较高的Mmc贵州分离株株，通过MmcLppA基因原核表达载体的构建与表达，建立基于表达产物MmcLppA蛋白的间接ELISA方法，并进行条件优化，制备成商品化间接ELISA试剂盒。该间接ELISA试剂盒的专利技术，将为Mmc引起的山羊间质性肺炎疫病的早期监测、免疫效果评价提供关键技术，对本病原所致疫病的早发现早防控具有重要意义。本专利技术的技术方案为：一种基于MmcLppA蛋白的间接ELISA试剂盒，间接ELISA试剂盒的原料配方为：包被酶标板1~5个，Mmc标准阳性血清0.5~1.5mL、Mmc标准阴性血清0.5~1.5mL、酶标二抗300-500μL、50×PBST缓冲液20-25mL、底物液A10mL-15mL、底物液B10mL-15mL和终止液10mL-15mL。包被酶标板为重组蛋白包被，重组蛋白为MmcLppA基因通过大肠杆菌Rosseta（DE3）表达系统获得LppA重组蛋白，并通过镍柱亲和层析法获得纯化蛋白，使用包被缓冲液稀释为1.0μg/100μL~3.0μg/100μL，室温包被酶标板12h，3g/100mL的BSA溶液，37℃封闭ELISA反应板1.5h后即为包被酶标板。Mmc标准阳性血清应用丝状支原体山羊亚种GZ-LD株免疫山羊获得的高免血清，按1:100稀释。Mmc标准阴性血清为采集自丝状支原体山羊亚种血清抗体阴性的山羊血清，按1:100稀释。所述酶标二抗为兔抗羊IgG-HRP，按1:2000稀释使用。所述50×PBST缓冲液为：NaCl400.0g、KCl10.0g、KH2PO410.0g、Na2HPO4·12H2O145g、Tween-2025mL溶于400~500mL蒸馏水，调整pH为7.2～7.6，定容至1000mL。所述底物液A为Na2HPO414.60g、柠檬酸9.33g、过氧化氢脲0.52g，溶于三蒸水，并定容至1000mL，调至pH5.0～5.4。所述底物液B为TMB20mg、无水乙醇8~10mL，加双蒸水至1000mL，过滤除菌，无菌分装。所述终止液为0.2%～0.3%HF溶液。一种基于MmcLppA蛋白的间接ELISA试剂盒的使用方法，包含以下步骤：第一，取包被酶标板，应用PBST洗涤ELISA反应板5次；第二，将阴、阳性对照血清及待检血清做1∶100倍稀释，按100μL加入酶标板反应孔中，37℃孵育1h后，应用PBS洗涤ELISA酶标板各反应孔5次；第三，将兔抗羊IgG-HRP用PBST做1:2000倍稀释，按100μL加入酶标板反应孔，37℃作用1h后，应用PBST洗涤酶标板反应孔5次；第四，将底物液A和B各50μL加入ELISA反应板，避光室温显色10~15min，加入50μL终止液，立即在酶标仪630nm波长下读取OD值；第五，试验成立条件为阳性血清OD630平均值≥3.069，阴性血清OD630平均值＜1.741；试验结果判定标准为待检样本OD630值≥2.738为阳性，待检样本OD630值＜2.738为阴性。本专利技术有益效果：本专利技术方法适用于检测羊Mmc感染抗体和免疫抗体，能够体现机体内Mmc感染水平或疫苗免疫效果，将为Mmc引起的山羊间质性肺炎疫病的早期监测、免疫效果评价及后续研究工作提供关键技术，对本病原所致疫病的早发现早防控具有重要意义，改变本病防控与监测缺乏商品化ELISA试剂盒的局面。本专利技术与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：（1）效果好：试剂盒能够较好的体现机体Mmc感染水平或疫苗免疫水平；本试剂盒相对于全菌蛋白包被，其敏感性、特异性更高，为Mmc引起的山羊和绵羊间质性肺炎的早期监测、疫苗免疫效果评价具有重要意义。（2）制备简单、生产成本低：本试剂盒相对于全菌蛋白包被，解决了Mmc培养困难、培养周期长等问题，且保证了试剂盒批次间可重复性、一致性，重组蛋白的大批量生产、纯化成本低，周期短，提高了市场推广可能。（3）经济、社会效益高：试剂盒的开发有效填补商品化试剂盒的缺失，且市场前景广阔，在内蒙古、新疆、贵州等山羊养殖区域具有广泛应用前景，可简化Mmc所致疫病程序，提高疫苗免疫效果，试剂盒的生产应用将产生良好的经济和社会效益。附图说明图1为本专利技术的MmcLppA蛋白的间接ELISA试剂盒制备生产流程图。具体实施方式本专利技术的实施例：基于MmcLppA蛋白的间接ELISA试剂盒原料及配方为：酶标板；Mmc标准阳性和标准阴性血清；重组蛋白为MmcLppA基因通过大肠杆菌Rosseta（DE3）表达系统获得LppA蛋白，并通过镍柱法蛋白纯化试剂盒进行重组蛋白纯化，纯化目的蛋白经包被缓冲液稀释为1.5μg/100μL；包被缓冲液：Na2CO31.59g、NaHCO32.93g溶于去离子水中，定容至1000mL，调至pH9.5～9.8；酶标二抗：兔抗羊IgG-HRP；1×本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于Mmc LppA蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：间接ELISA试剂盒的原料配方为：包被酶标板1~5个，Mmc标准阳性血清0.5~1.5mL、Mmc标准阴性血清0.5~1.5mL、酶标二抗300‑500μL、50×PBST缓冲液20‑25mL、底物液A10mL‑15mL、底物液B10mL‑15mL和终止液10mL‑15mL。

【技术特征摘要】
1.一种基于MmcLppA蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：间接ELISA试剂盒的原料
配方为：包被酶标板1~5个，Mmc标准阳性血清0.5~1.5mL、Mmc标准阴性血清0.5~1.5mL、酶标
二抗300-500μL、50×PBST缓冲液20-25mL、底物液A10mL-15mL、底物液B10mL-15mL和终止液
10mL-15mL。
2.根据权利要求1所述一种基于MmcLppA蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：包被
酶标板为重组蛋白包被，重组蛋白为MmcLppA基因通过大肠杆菌Rosseta（DE3）表达系统获
得LppA重组蛋白，并通过镍柱亲和层析法获得纯化蛋白，使用包被缓冲液稀释为1.0μg/100
μL~3.0μg/100μL，室温包被酶标板12h，3g/100mL的BSA溶液，37℃封闭ELISA反应板1.5h
后即为包被酶标板。
3.根据权利要求1所述一种基于MmcLppA蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：Mmc标
准阳性血清应用丝状支原体山羊亚种GZ-LD株免疫山羊获得的高免血清，按1:100稀释。
4.根据权利要求1所述一种基于MmcLppA蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：Mmc标
准阴性血清为采集自丝状支原体山羊亚种血清抗体阴性的山羊血清，按1:100稀释。
5.根据权利要求1所述一种基于MmcLppA蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：所述
酶标二抗为兔抗羊IgG-HRP，按1:2000稀释使用。
6.根据权利要求1所述一种基于MmcLppA蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：所述
50×PBST缓冲液为：NaCl400.0g、KCl10.0g、KH2PO410.0g、Na2HPO4·12H2O145...

【专利技术属性】
技术研发人员：程振涛，吴燕，文明，王开功，周碧君，岳筠，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52