用于测定DNA的组织或细胞来源的方法和试剂盒技术

公开了检测受试者的细胞类型或组织的死亡的方法。所述方法包括测定受试者的流体样品中包含的无细胞DNA是否来源于所述细胞类型或组织，其中所述测定通过确定无细胞DNA的连续序列上至少4个甲基化位点的甲基化状态来实现，所述序列包含不超过300个核苷酸，其中所述细胞类型或组织特有的DNA的连续序列上所述至少4个甲基化位点的每一个的甲基化状态指示所述细胞类型或组织的死亡。还公开了用于检测细胞死亡的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
和背景本专利技术，在其一些实施方案中，涉及测定无细胞DNA的来源的方法和其用于诊断与细胞死亡有关的病理过程、监测意图改变细胞死亡的治疗方案例如药物的用途，和其为临床和科研目的而研究影响细胞死亡水平的过程的用途。数十年来已知血浆包含源自死亡细胞的无细胞循环DNA(cfDNA)的小片段(平均5000个基因组当量/ml)。尽管释放和清除cfDNA的基础机制仍不清楚，但该现象迅速用于与临床有关的各种应用。胎儿DNA的片段短暂在母体循环中移动的公认打开了基于下一代测序(NGS)的产前检验以鉴定胎儿三体性和其它遗传畸变的道路，有可能代替羊膜穿刺术。在癌症生物学中，已知肿瘤释放DNA(包括肿瘤-特异性体细胞突变)至循环，提供了用于液体活检以监测肿瘤动力学和基因组进化的手段。此外，根据区分供体与受体的DNA的单核苷酸多态性(SNPs)，cfDNA已用于检测在肾、肝或心脏移植后的移植物细胞死亡。在所有这些情况中，在目的组织(胎儿、肿瘤或移植物)和宿主的DNA序列之间存在遗传差异，这提供了高度特异性测定法的基础。已知在多种另外的条件例如创伤性脑损伤、心血管疾病、脓毒症和强烈运动时，cfDNA的血液水平增加。然而在这些情况下，升高的cfDNA的来源是未知的，极大地损害了cfDNA作为诊断或预后工具的功用。例如，cfDNA可能来源于受损伤组织的实质细胞，但也可能来源于临死的炎性细胞。尽管具有相同的核苷酸序列，但体内各细胞类型的DNA带有与其基因表达谱相关的独特的表观遗传标记。具体而言，用来抑制非转录的基因的DNA甲基化，是组织身份的基本方面。对各细胞类型而言，甲基化模式是独特的，在相同个体和个体之间的相同类型的细胞中保守，并且在生理或病理条件下高度稳定。因此，使用cfDNA的DNA甲基化模式来测定其来源组织并因此推断来源器官中的细胞死亡是可能的。在理论上，考虑到cfDNA的总量、源自目的组织的分数和估计的cfDNA半寿期(15-120分钟)，这样的方法可鉴定目的组织中的细胞死亡比率。注意，因为该方法依赖于细胞身份的正常的稳定标记，其不能鉴定病理的性质(例如，区分源自死亡肿瘤细胞或由于在相同组织中创伤或炎症导致的死亡野生型细胞的cfDNA)。组织特异性细胞死亡的高度敏感性、最小侵入测定的潜在用途包括早期准确诊断以及在临床和药物开发背景中监测对疗法的反应。组织-特异性DNA甲基化的经典实例由胰岛素基因启动子提供，其在产生胰岛素的胰腺β-细胞中未甲基化和在别处甲基化。最近的研究在新诊断的T1D患者的循环中以及在胰岛移植物受体中鉴定了未甲基化胰岛素启动子DNA，可能反映了β–细胞的自身免疫和同种免疫破坏两者(AkiravE.M.等ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,108,19018-19023(2011);LebastchiJ等,Diabetes62,1676-1680(2013);HusseinyM.I.Plosone9e94591(2014;和HeroldK.C.等,JClinInvest.Doi:10.1172/jc178142(2015))。其它
技术介绍
包括国际PCT公开号WO2013131083、WO2014138133和WO201101728。专利技术概述根据本专利技术的一些实施方案的一个方面，提供检测受试者的细胞类型或组织的死亡的方法，包括测定受试者的流体样品中包含的无细胞DNA是否来源于所述细胞类型或组织，其中所述测定通过确定无细胞DNA的连续序列上至少4个甲基化位点的甲基化状态来实现，所述序列包含不超过300个核苷酸，其中所述细胞类型或组织特有的DNA的连续序列上至少4个甲基化位点的每一个的甲基化状态指示细胞类型或组织的死亡。根据本专利技术的一些实施方案的一个方面，提供鉴定目的细胞类型或组织的甲基化标记的方法，包括在目的细胞类型的DNA中鉴定包含至少4个甲基化位点的不超过300个核苷酸的连续序列，其中相对于第二种不同的细胞类型或组织，所述位点的每一个被差异甲基化，从而鉴定目的细胞类型或组织的甲基化标记。根据本专利技术的一些实施方案的一个方面，提供测定样品中的DNA是否来源于目的细胞类型或组织的方法，所述方法包括：确定DNA的连续序列上至少4个甲基化位点的甲基化状态，所述序列包含不超过300个核苷酸，其中目的细胞特有的连续序列的至少4个甲基化位点的每一个的甲基化状态指示DNA来源于目的细胞。根据本专利技术的一些实施方案的一个方面，提供用于鉴定样品中的DNA来源的试剂盒，其包含能够检测核酸序列中至少4个甲基化位点的甲基化状态的寡核苷酸，所述核酸序列不超过300个碱基对和包含相对于与第一种目的细胞不同的第二种细胞，在第一种目的细胞中差异甲基化的至少4个甲基化位点。根据本专利技术的一些实施方案的一个方面，提供用于鉴定样品中的DNA来源的试剂盒，其包含能够扩增具有不超过300个碱基对的核酸序列的DNA的至少两种寡核苷酸，其中所述核酸序列包含相对于与第一种目的细胞不同的第二种细胞，在第一种目的细胞中差异甲基化的至少4个甲基化位点。根据本专利技术的一些实施方案，所述甲基化状态是非病变目的细胞类型或组织特有的。根据本专利技术的一些实施方案，所述序列包含50-250个核苷酸。根据本专利技术的一些实施方案，当所述细胞类型的死亡与病理过程有关时，所述方法还包括诊断所述病理过程。根据本专利技术的一些实施方案，所述DNA是无细胞DNA。根据本专利技术的一些实施方案，所述DNA是细胞DNA。根据本专利技术的一些实施方案，所述方法还包括在测定之前裂解细胞DNA的细胞。根据本专利技术的一些实施方案，至少4个甲基化位点包含至少5个甲基化位点。根据本专利技术的一些实施方案，目的细胞类型包含在体液内。根据本专利技术的一些实施方案，样品包含体液。根据本专利技术的一些实施方案，所述体液选自血液、血浆、精液、乳、尿、唾液和脑脊液。根据本专利技术的一些实施方案，所述确定使用至少一种甲基化-依赖性寡核苷酸实现。根据本专利技术的一些实施方案，所述甲基化-依赖性寡核苷酸与4个甲基化位点的至少1个杂交，所述位点是甲基化的。根据本专利技术的一些实施方案，所述甲基化-依赖性寡核苷酸与4个甲基化位点的至少1个杂交，所述位点是未甲基化的。根据本专利技术的一些实施方案，所述确定使用甲基化-非依赖性寡核苷酸实现。根据本专利技术的一些实施方案，所述确定使用至少两种甲基化-非依赖性寡核苷酸实现。根据本专利技术的一些实施方案，所述确定通过以下实现：(a)使样品中的DNA与亚硫酸氢盐接触，以转化DNA的去甲基化胞嘧啶为尿嘧啶；(b)使用与邻近DNA的连续序列上的至少4个甲基化位点的第一个和最后一个的核酸序列杂交的寡核苷酸，扩增DNA的连续序列；和(c)对DNA的连续序列测序。根据本专利技术的一些实施方案，样品包含来源于与所述细胞类型或组织不同的第二种细胞的无细胞DNA。根据本专利技术的一些实施方案，所述方法还包括分析源自所述细胞类型或组织的无细胞DNA的量:源自第二种细胞的无细胞DNA的量。根据本专利技术的一些实施方案，所述方法还包括分析源自所述细胞类型或组织的无细胞DNA的量:样品中无细胞DNA的总量。根据本专利技术的一些实施方案，所述细胞类型选自胰腺β细胞、胰腺本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测受试者的细胞类型或组织的死亡的方法，包括测定受试者的流体样品中包含的无细胞DNA是否来源于所述细胞类型或组织，其中所述测定通过确定无细胞DNA的连续序列上至少4个甲基化位点的甲基化状态来实现，所述序列包含不超过300个核苷酸，其中所述细胞类型或组织特有的DNA的所述连续序列上的所述至少4个甲基化位点的每一个的甲基化状态指示细胞类型或组织的死亡。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.14 US 61/9792331.检测受试者的细胞类型或组织的死亡的方法，包括测定受试者的流体样品中包含的无细胞DNA是否来源于所述细胞类型或组织，其中所述测定通过确定无细胞DNA的连续序列上至少4个甲基化位点的甲基化状态来实现，所述序列包含不超过300个核苷酸，其中所述细胞类型或组织特有的DNA的所述连续序列上的所述至少4个甲基化位点的每一个的甲基化状态指示细胞类型或组织的死亡。2.鉴定目的细胞类型或组织的甲基化标记的方法，包括在目的细胞类型的DNA中鉴定包含至少4个甲基化位点的不超过300个核苷酸的连续序列，其中相对于第二种不相同的细胞类型或组织，所述位点的每一个被差异甲基化，从而鉴定所述目的细胞类型或组织的甲基化标记。3.测定样品中的DNA是否来源于目的细胞类型或组织的方法，所述方法包括：确定所述DNA的连续序列上至少4个甲基化位点的甲基化状态，所述序列包含不超过300个核苷酸，其中所述目的细胞特有的所述连续序列上所述至少4个甲基化位点的每一个的甲基化状态指示所述DNA来源于所述目的细胞。4.权利要求1或3的方法，其中所述甲基化状态是非病变目的细胞类型或组织特有的。5.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述序列包含50-250个核苷酸。6.权利要求1的方法，其中当所述细胞类型的死亡与病理过程有关时，所述方法还包括诊断所述病理过程。7.权利要求2或3的方法，其中所述DNA是无细胞DNA。8.权利要求2或3的方法，其中所述DNA是细胞DNA。9.权利要求8的方法，其中所述方法还包括在所述测定之前裂解所述细胞DNA的细胞。10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述至少4个甲基化位点包含至少5个甲基化位点。11.权利要求2的方法，其中所述目的细胞类型包含在体液中。12.权利要求3的方法，其中所述样品包含体液。13.权利要求1、11或12的方法，其中所述体液选择血液、血浆、精液、乳、尿、唾液和脑脊液。14.权利要求1或3-13中任一项的方法，其中所述确定使用至少一种甲基化-依赖性寡核苷酸实现。15.权利要求14的方法，其中所述甲基化-依赖性寡核苷酸与所述4个甲基化位点的至少1个杂交，所述位点是甲基化的。16.权利要求14的方法，其中所述甲基化-依赖性寡核苷酸与所述4个甲基化位点的至少1个杂交，所述位点是未甲基化的。17.权利要求1或3-13中任一项的方法，其中所述确定使用甲基化-非依赖性寡核苷酸实现。18.权利要求1或3-13中任一项的方法，其中所述确定使用至少两种甲基化-非依赖性寡核苷酸实现。19.权利要求1、3-13、17或18中任一项的方法，其中所述确定通过以下实现：(a)使样品中的DNA与亚硫酸氢盐接触，以将DNA的去甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶；(b)使用与在DNA的所述连续序列上邻近所述至少4个甲基化位点的第一个和最后一个的核酸序列杂交的寡核苷酸，扩增DNA的所述连续序列；和(...

【专利技术属性】
技术研发人员：Y多尔，R舍梅，B格拉赛，
申请(专利权)人：耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展公司，哈达锡特医学研究服务及发展有限公司，
类型：发明
国别省市：以色列;IL