餐时或基础胰岛素类似物通过内部二硒桥的稳定化制造技术

本文公开了胰岛素类似物，其含有在A6和A11位用硒代半胱氨酸残基进行的成对半胱氨酸取代，使得在这些位置之间形成二硒桥。[Sec

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】餐时或基础胰岛素类似物通过内部二硒桥的稳定化
[0001]相关申请的交叉引用本申请要求2019年4月19日提交的第62/836,264号美国临时专利申请的优先权，其内容通过全文引用并入本申请。
[0002]关于联邦赞助的声明研究或开发本专利技术是在美国国立卫生研究院授予的DK 040949和DK 118536的政府支持下完成的。政府具有本专利技术的某些权利。
[0003]通过引用并入电子提交的材料通过全文引用并入的是一段计算机可读核苷酸/氨基酸序列表，其与本文同时提交且如下识别：2020年4月16日创建的名为“315514_ST25.txt,”的24千字节ACII(文本)文件。

技术介绍

[0004]胰岛素是由双链异源二聚体组成的肽激素，其通过酶处理从低效力单链胰岛素原前体经生物合成得到。人胰岛素由通过二硫键结合在一起并具有总共51个氨基酸(aa)的两条肽链(“A链”(SEQ ID NO: 2)和“B链”(SEQ ID NO: 4))组成。A链和B链以三维结构缔合以组装接触面，使得能够高亲和力结合胰岛素受体。这些表面在受体结合时相对于游离激素部分重组。
[0005]胰岛素及其类似物通过细胞进入显示出降低血液中葡萄糖浓度的无可比拟的能力。事实上在所有形式的糖尿病(DM)中，血糖浓度的异常增加是关键问题。野生型(WT)人胰岛素和其他动物胰岛素分子(如在其他脊椎动物的基因组中编码的)与多种器官和不同类型的细胞中的胰岛素受体(IR)结合，而不考虑通过RNA剪接的替代模式产生的(称为同种型A或B；IR
‑
>A或IR
‑
B)且通过翻译后糖基化的模式进一步精制(其可为组织特异性的)的受体同种型。WT人胰岛素和其它动物胰岛素的药代动力学和药效动力学(PK/PD)性质在患有DM的患者的亚组中常常是次优的。在过去三十年中，相关的未满足的医疗需求导致了胰岛素类似物的设计、开发和临床应用(Sharma, A.K.等人, 2019)。胰岛素类似物制剂的两个主要类别是(i)比常规人胰岛素制剂(N
ø
rgaard, K.等人, 2018)从皮下贮库更快速吸收的那些(且因此更速效)和(ii)比鱼精蛋白相关的WT人胰岛素的微晶悬浮液(Hompesch, M.等人, 2019)较不快速吸收(且因此更缓效和更持久)的那些。这些类别分别称为餐时类似物制剂或基础类似物制剂。
[0006]遗憾的是，目前临床应用的餐时和基础胰岛素类似物制剂在室温或高于室温下一般比含有WT人胰岛素的制剂，尤其是胰岛素泵中使用的速效胰岛素类似物制剂更易受化学和物理降解的影响(Woods, R.J.等人, 2012)。实际上，只有一种本领域已知的临床胰岛素类似物制剂表现出比WT胰岛素(基础产品Tresiba
®
；Novo
‑
Nordisk)更大的保存期稳定性。因此，持续需要表现出增强的药学性质的治疗性胰岛素类似物，比如在室温或高于室温下增加的热力学稳定性和提高的对热纤颤的抗性。
ꢀ
[Sanofi]的活性组分)。作为这些性质的结果，美国食品和药品管理局已经对这种产品在室温或高于室温下的储存和使用施加了限制。
[0011]为了减轻胰岛素类似物制剂不稳定性，过去努力在胰岛素的表面上采用常规的氨基酸取代，包括引入一个或多个跨越不参与受体结合的表面的其他二硫桥。这种表面取代或修饰的效用被受体结合性质或信号传导性质中未预料和不期望的变化挫败，比如在长期施用胰岛素类似物时导致癌症风险升高的促有丝分裂性增加(在B链表面上的稳定Asp
B10
取代的情况下)或异常延长的细胞信号传导(在残基B4和A10之间的工程改造化的二硫桥的情况下)。因此，其他二硫桥的效用被生物学性质中未预料和不期望的变化挫败，比如一旦IR参与就延长的信号传导，也引起对癌症诱发的关注。由于胰岛素核心的进化保守性和它结构的精巧性，在胰岛素内部常规的氨基酸取代一般与降低的热力学稳定性有关；据我们所知，尚未鉴定出这样的具有增强的稳定性的核心取代。
[0012]由于在去折叠的自由能()和纤颤发生之前的滞后时间之间缺乏一致的关联，发现防止纤颤的修饰的挑战已被放大。本专利技术利用了硒代半胱氨酸相对于半胱氨酸(Sec对Cys；图2A)独特的物理化学性质。正如两个Cys残基可配对形成二硫桥(胱氨酸)，两个Sec残基可配对形成二硒桥(图2B和2C)。本公开的一个令人惊讶的方面是，在速效胰岛素类似物内部或在基础胰岛素类似物内部的残基A6和A11中的硫原子被硒原子的成对取代应当增强稳定性并防止纤颤，而不改变受体结合亲和力。胱氨酸A6
‑
A11的位置示于图3；描述胰岛素纤颤途径的机制示意图示于图4。因此，本公开从与本领域已知的氧化
‑
还原化学的传统看法不相关的角度看待硒代半胱氨酸和硒代胱氨酸化学(Beld, J.等人, 2007, 2008, 2010)。
[0013]WT动物胰岛素的基线不稳定性和它们在药物制剂中对化学和物理降解的固有敏感性一般通过包含锌离子来减轻，这促进Zn
2＋
‑
配位的胰岛素六聚体的天然组装。这样的六聚物在其内部含有两个轴向锌离子，并且表现出比无锌胰岛素溶液更大的稳定性。含锌胰岛素制剂一般比缺少锌离子的对应制剂表现出保存期(Brange, J. (1987) in Galenics of insulin, Springer, Berlin, Germany [https://doi.org/10.1007/978
‑3‑
662
‑
02526
‑
0_3])。由于它们较低的热力学稳定性和对纤颤增加的敏感性，目前临床应用的某些胰岛素类似物(比如赖脯胰岛素和门冬胰岛素)中的氨基酸取代加剧了对锌离子的需求。因此，期望增强胰岛素类似物的固有稳定性和它们对纤颤的抗性，使得药物制剂可包含赋形剂，该赋形剂可有利地增强胰岛素从皮下贮库中吸收的速度或效率，但会与胰岛素竞争锌离子的结合。本领域已知的这种赋形剂的实例包括三磷酸盐离子、三硫酸盐离子和二价离子螯合剂，包括乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇
‑
双(β
‑
氨基乙基醚)
‑
N,N,N',N'
‑
四乙酸(EGTA)。
[0014]因此，希望提供一类新的类别的速效和长效胰岛素类似物，其单体结构在热力学基础上稳定，使得在构象折叠平衡中的全局去折叠最小化，并且使得近全局(subglobal)构象波动也被抑制。增强的稳定性和抑制的波动分别与降低的化学降解和物理降解速率相关，一起导致在室温或高于室温下延长的保存期。更一般地，需要一种稳定胰岛素分子而不改变其受体结合表面的分子设计策略。
[0015]通过提供含有在位置A6和A11处半胱氨酸被硒代半胱氨酸(Sec)成对取代的胰岛素类似物，申请人满足了所述需求。后一氨基酸(其天然存在于人体中并被认为是“第21个
编码的氨基酸”)含有单个原子取代：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1. 一种胰岛素类似物，其包含胰岛素A链和胰岛素B链，其中所述A链包含GIVEQX6CX8X9IX
11
SLYQLENYCX
21
‑
R
53 (SEQ ID NO: 17)的序列；且所述B链包含序列FVX
23
QX
25
LCGX
29
X
30
LVX
33
X
34
LYLVCGX
41
X
42
GFX
45 (SEQ ID NO: 18)，其中X6为硒代半胱氨酸；X8为组氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸或色氨酸；X9为丝氨酸、赖氨酸或丙氨酸；X
11
为硒代半胱氨酸；X
21
选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和天冬氨酸；X
23
为Asn或Lys；X
25
为组氨酸、精氨酸或苏氨酸；X
29
选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；X
30
选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、同型半胱氨酸和磺基丙氨酸；X
33
选自天冬氨酸和谷氨酸；X
34
选自丙氨酸和苏氨酸；X
41
选自谷氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺；X
42
选自丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸和精氨酸；X
45
为酪氨酸或苯丙氨酸；且R
53
为COOH或CONH2。2. 权利要求1所述的胰岛素类似物，其中所述A链包含GIVEQX6CX8SIX
11
SLYQLENYCX
21
‑
R
53 (SEQ ID NO: 15)的序列，且所述B链包含序列FVX
23
QX
25
LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTX
48
X
49
X
50 (SEQ ID NO: 16)，其中X6为硒代半胱氨酸；X8为组氨酸、精氨酸或苏氨酸；X
11
为硒代半胱氨酸；X
21
为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；X
23
为Asn或Lys；X
25
为组氨酸或苏氨酸；X
48
为脯氨酸、赖氨酸或天冬氨酸；X
49
为脯氨酸、赖氨酸或甘氨酸；X
50
为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸；且R
53
为COOH或CONH2。3. 权利要求1所述的胰岛素类似物，其中B链序列包含序列FVKQX
25
LCGSHLVEALYLVCGERGFF
‑
R
63 (SEQ ID NO: 21)或FVNQX
25
LCGSHLVEALYLVCGERGFF
‑
R
63 (SEQ ID NO: 20)，其中X
25
选自组氨酸和苏氨酸；且R
63
选自YTX
28
KT (SEQ ID NO: 22)、YTKPT (SEQ ID NO: 23)、YTX
28
K (SEQ ID NO: 24)、YTKP (SEQ ID NO: 25)、YTPK (SEQ ID NO: 26)、YTX
28
、YT、Y和键，其中X
28
为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。4. 权利要求3所述的胰岛素类似物，其中B链序列包含序列FVKQX
25
LCGSHLVEALYLVCGE
RGFFYTEKT (SEQ ID NO: 28)、FVNQX
25
LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT (SEQ ID NO: 27)、FVNQX
25
LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT (SEQ ...

【专利技术属性】
技术研发人员：N，
申请(专利权)人：耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展公司，
类型：发明
国别省市：