用于检测骨髓异常增生综合征MDS基因突变的引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种用于检测骨髓异常增生综合征(MDS)基因突变的引物组合、含有该引物组合的试剂盒以及检测MDS基因突变的方法。本发明专利技术针对常见的四种MDS基因，设计了能够高效特异性扩增这四种基因的引物序列，具有高度的特异性。本发明专利技术设计的所有引物的退火温度均为58℃，可以使用同一个PCR程序一次完成扩增反应。本发明专利技术所呈现的测序峰图背景清晰、信号值高，大大降低了对突变的分析难度，并且本发明专利技术设计的引物、试剂盒以及检测方法成本经济，特异性强。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，具体涉及用于检测骨髓异常增生综合征MDS基因突变的引物、试剂盒及方法。
技术介绍
骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndrome，MDS)是一组以骨髓病态造血、无效造血和高风险白血病转化为特征的造血干细胞克隆性疾病。临床以病态发育的血细胞形态学、细胞遗传学异常，外加在多数病例中有原始细胞数不同程度的增多和血细胞减少症的存在为主要特征。目前MDS的治疗主要解决两大问题：骨髓衰竭及并发症和AML转化。随着MDS中越来越多的基因异常被发现以及分子生物学技术的不断发展，其发病机制中多种分子标志物也逐渐被揭示。其中，多种基因被发现与MDS向急性髓系白血病转化密切相关。近年来，有研究显示RNA剪接因子3B第一亚单位(splicingfactor3Bsubunit1，SF3B1)基因突变与MDS患者环状铁幼粒细胞的出现密切相关。另外，富含丝氨酸/精氨酸剪接因子2(serine/arginine-richsplicingfactor，SRSF2)也被报道与MDS发病密切相关，该基因突变提示患者可能预后不良，并较未突变者有更高的向AML转化的几率。与DNA甲基化密切相关的DNMT3A的突变多预示着较差的总生存率，并可能更快地向AML转化。此外，调节组蛋白合成的ASXL1的框移突变被证实为MDS预后不良的分子标志。对MDS进行多基因检测可能有助于其诊断及进行进一步危险分层，最终实现更为精确的个体化治疗。由于与MDS发病相关的基因突变较多，因而检测方法不一，主要包括直接测序、实时荧光定量PCR、高分辨率溶解曲线等。相较于其他检测方法，直接测序能够对需要检测样本的相关基因序列进行精确测序，从而分析相关基因是否发生突变，具有简便、准确且适合批量操作的特点。目前有不少关于直接测序检测MDS相关基因突变的报道，然而往往由于引物特异性不是很好，造成测序峰图有较高背景峰，从而对突变的判断造成一定困难。因此，目前亟需一种快速、灵敏、成本经济的对MDS常见4种基因(SF3B1、ASXL1、SRSF2、DNMT3A)突变进行检测的方法。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的上述缺陷，根据GenBank最新公布的基因序列，重新设计了检测MDS常见4种基因突变的引物，并在此基础上设计了对这4种基因突变进行检测的方法。本专利技术的方法快速、简便、准确、灵敏、直观，且实验成本低。为此，本专利技术一方面提供了一种用于检测骨髓异常增生综合征(MDS)基因突变的引物组合，其由SEQIDNO.1-30所示的引物组成，所述MDS基因为SF3B1、ASXL1、SRSF2和DNMT3A。在本专利技术优选的实施方案中，该引物组合进一步由第1-4组引物组成，其中第1组由SEQIDNO.1-6所示的引物组成，第2组由SEQIDNO.7-24所示的引物组成，第3组由SEQIDNO.25-28所示的引物组成，第4组由SEQIDNO.29-30所示的引物组成。在本专利技术进一步优选的实施方案中，每条引物的浓度均为5μM。本专利技术另一方面提供了一种用于检测MDS基因突变的试剂盒，其包含本专利技术所述的引物组合，所述MDS基因为SF3B1、ASXL1、SRSF2和DNMT3A。在本专利技术优选的实施方案中，每条引物的浓度均为5μM。本专利技术另一方面提供了本专利技术所述的引物组合在制备检测MDS基因突变的试剂盒中的应用，所述MDS基因为SF3B1、ASXL1、SRSF2和DNMT3A。本专利技术再一方面提供了本专利技术所述的引物组合，或者本专利技术所述的试剂盒在检测MDS基因突变中的应用，所述MDS基因为SF3B1、ASXL1、SRSF2和DNMT3A。本专利技术最后一方面提供了一种检测MDS基因突变的方法，其包含以下步骤：1、获取待测样品DNA。2、采用本专利技术所述的引物组合，或采用本专利技术所述的试剂盒，以步骤1中获取的DNA为模板，进行PCR扩增。3、对PCR扩增产物进行Sanger测序。4、得到测序峰图后，进行结果判读，获得待测样品中MDS基因突变的种类。所述MDS基因为SF3B1、ASXL1、SRSF2和DNMT3A。在本专利技术优选的实施方案中，步骤2中每条引物的浓度均为5μM。在本专利技术进一步优选的实施方案中，步骤3中还包括测序反应后进行纯化以及进行变性处理的步骤。由上述描述可知，与现有技术相比，本专利技术具备如下优点。1、本专利技术根据GenBank最新公布的基因序列，针对常见的四种MDS基因SF3B1、ASXL1、SRSF2和DNMT3A，采用不同的引物设计，设计了能够高效特异性地扩增这四种MDS基因的引物序列，具有高度的特异性。2、本专利技术设计的所有引物的退火温度均为58℃，可以使用同一个PCR程序一次完成扩增反应。PCR反应可以将四种基因的所需检测区域全部扩增出来，然后进行测序，并将测得的序列与标准序列比对，检测是否存在基因突变。除了对比已确认的突变外，还能发现新的突变。3、本专利技术采用Sanger测序法，可检测MDS相关的四种基因突变，而且本专利技术设计的引物所扩增的产物覆盖所有待检测突变位点，在很大程度上节省了检测时间及成本，而且结果更准确。综上所述，本专利技术所呈现的测序峰图背景清晰、信号值高，大大降低了对突变的分析难度，并且本专利技术设计的引物、试剂盒以及检测方法成本经济，特异性强。附图说明图1：ASXL1基因突变的测序峰图。图2：DNMT3A基因野生型与突变型的对比图。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术作进一步的详细说明，旨在用于说明本专利技术而非限定本专利技术。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以对本专利技术进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本专利技术的保护范围之内。实施例1：设计用于检测MDS常见4种基因突变的PCR引物本实施例中，根据GenBank最新公布的基因序列，利用PrimerPremier5.0引物设计软件设计PCR引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。为了减少测序峰图底峰，最大限度地保障了测序引物的纯度，通过引物反应条件的优化和比较，筛选出了特异性好的引物。按照上述引物设计原则，本专利技术针对MDS常见4种基因突变所设计的具体引物情况参见表1。表1：四种基因的扩增及测序引物序列实施例2：制备用于检测MDS常见4种基因突变的试剂盒将合成的引物，PCR扩增反应液和测序体系进行分装后包装，组成本专利技术试剂盒。其中，PCR扩增反应液包括，10×PCRBuffer、2.5mMdNTPs、LATaqDNAPolymerase、ddH2O等。测序体系包括，PCR产物消化反应液：虾碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatas(Shrimp))和外切酶(ExonucleaseI)按1:1进行混合；测序反应液：TerminatorV3.1cycleSequencingKit、5×Bigdyebuffer；测序纯化液：EDTA(125mM)；85％无水乙醇；75％无水乙醇；HI-DI(高度去离子甲酰胺)。实施例3：对样本中MDS基因突变进行检测按照以下具体步骤对样本中的MDS基因突变进行检测：1、按照QIAampDNABloodMinikit试剂盒的方法提取样本DNA。2、以上述DNA为模板，和所述的PCR扩增引物进行PCR扩增反应，得到本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测骨髓异常增生综合征(MDS)基因突变的引物组合，其由SEQ ID NO.1‑30所示的引物组成，所述MDS基因为SF3B1、ASXL1、SRSF2和DNMT3A。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测骨髓异常增生综合征(MDS)基因突变的引物组合，其由SEQIDNO.1-30所示的引物组成，所述MDS基因为SF3B1、ASXL1、SRSF2和DNMT3A。2.根据权利要求1所述的引物组合，其进一步由第1-4组引物组成，其中第1组由SEQIDNO.1-6所示的引物组成，第2组由SEQIDNO.7-24所示的引物组成，第3组由SEQIDNO.25-28所示的引物组成，第4组由SEQIDNO.29-30所示的引物组成。3.根据权利要求1或2所述的引物组合，其中每条引物的浓度均为5μM。4.一种用于检测MDS基因突变的试剂盒，其包含权利要求1-3中任一项所述的引物组合，所述MDS基因为SF3B1、ASXL1、SRSF2和DNMT3A。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中每条引物的浓度均为5μM。6.权利要求1-3中任一项所述的引物组合在制备检测MDS基因突变的试剂盒中的应用，...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑仲征，杜金伟，徐玉尚，郁晓晨，杨兰，安雪茹，余凯，潘捷，杜可明，王宁娟，胡莹，
申请(专利权)人：上海荻硕贝肯医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31