本发明专利技术属于底栖动物鉴定与分类技术领域。具体涉及一种环棱螺类线粒体COⅠ基因的扩增引物及其应用。发明专利技术的特征在于，通过同一亚纲下的部分物种COⅠ基因序列设计其特异性引物及扩增验证，主要包括：(1)提取环棱螺属样本组织的总DNA；(2)根据NCBI核酸数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)中发布的前鳃亚纲软体动物线粒体COⅠ全序列，通过Clustal W2对其进行比对分析，设计特异性引物并合成；(3)采用该引物按照标准PCR体系和程序对需要鉴定的环棱螺个体的COⅠ基因进行扩增；(4)优化拼接测序结果，在NCBI核酸数据库中通过BLAST对测序结果进行比对。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于底栖动物鉴定与分类
具体涉及一种环棱螺类线粒体COⅠ基因的扩增引物及其应用。
技术介绍
物种鉴定和分类是进行生物学研究的基本条件，据估计，地球上大约有500万到1亿种现存的生物物种，而目前分类学家用传统学分类方法能够鉴定的物种只有约170万种。如今世界面临维持遗传多样性、生物物种多样性和避免流行病的发生等诸多严峻的问题，而解决这些问题的前提是能够对生物物种进行正确的鉴定和分类(Frezal&Leblois,2008)。然而，对于地球上庞大的生物群体来说，物种鉴定和分类是一项艰巨的任务。随着PCR技术的快速发展，2003年，加拿大圭尔夫大学(GuelphUniversity)的Hebert教授首次提出利用线粒体细胞色素c氧化酶Ⅰ(CytochromecoxidasesubunitⅠ,COⅠ)来构建物种鉴别体系(Hebertetal，2003)，即DNA条形码(DNAbarcoding)。人们期待这一技术像在零售业的发展中起到了重要作用的条形码技术一样，根据对一个统一的目标基因序列的分析来完成物种鉴定的过程(Dayrat,2005)。环棱螺隶属于腹足纲(Gastropoda)，中腹足目(Mesogastropoda)，田螺科(Viviparidae)。螺壳中等大，圆锥形或低锥形，螺层面近乎平直。体螺层大，具螺棱(环棱)。壳口卵圆形，边缘完整。厣角质，卵圆形，平滑，上有同心环状排列的生长纹。体柔软，头部圆柱形，前端有突出的口吻；口基部有触角1对，每1触角基部的外侧，各有隆起的眼1个。足位于头部下方，形大，跖面宽阔。头和足能缩入壳内，缩入后，其厣即将螺壳封闭(顾钱洪，2013)。主要生活于河沟、湖泊、池沼内。多栖息于腐殖质较多的水底。以藻类及其他植物的表皮为食。现主要分布于亚洲、非洲、北美和大洋洲(Brown,D.S，1994)。我国大部地区均有分布，特别是在湖泊中尤为常见。环棱螺是淡水底栖动物群落的重要组成类群，参与水生态系统的一些重要生态过程。环棱螺肉味鲜美，是人们喜食的螺类之一，而且具有一定得药用价值。同时，环棱螺在水生态系统中的作用被逐渐发现，国内外生态学者对环棱螺在环境污染物生物积累、种群动态变化等资源调查和环境监测与评估等方面做了大量的研究。环棱螺属主要依据螺壳形态特征分类，而形态特征的描述可能带有一定的主观性，且易随环境变化而发生较大变化。环棱螺属种类较多，仅仅依靠螺壳形态描述来区分种类容易混淆，而且也比较困难。国内部分研究人员提出将齿舌特征作为其分类鉴定的依据(吴小平等，2004)，该项技术对实验技术要求较高，且必须依赖于扫描电镜等高端仪器设备。在国内外关于环棱螺分子鉴定分类研究方面，虽然已有基于COⅠ基因序列的相关研究(VanBocxlaerB&HuntG，2013)，但扩增引物均以后生动物门通用引物，扩增片段较短(约700bp)，得到的相关基因信息较少，易与假线粒体基因混淆。迄今为止尚未见到有关环棱螺属物种特异性引物设计和测序结果的评估方面的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在提供一种环棱螺类线粒体COⅠ基因扩增引物，并通过扩增和测序验证其特异性。该方法操作简单，易学易会，特别适合实验室新手使用。所开发的环棱螺特异性引物对该群体的COⅠ基因扩增效率高，扩增片段长(是传统后生动物门通用引物扩增长度的两倍)，获得的遗传信息较多，可用于该类物种分子辅助鉴定的分子标记和系统发育研究。本专利技术通过以下技术方案实现：一种环棱螺类线粒体COⅠ基因扩增引物的应用方法，包括下列步骤：(1)取鲜活、冷冻或用无水乙醇浸泡的环棱螺属样本个体少量肌肉组织，采用常规SDS-碱裂解法提取每只样本总DNA(或采用试剂盒提取其总DNA)，检测纯度后稀释至50ng/μl，作为模板DNA，置于-20℃备用；同时妥善保存其外壳等剩余样本组织；(2)依据形态分类资料确定环棱螺属种类的分类地位，依次鉴定到动物分类学的门(例如确定其隶属于后生动物门)、纲(例如腹足纲)、亚纲(例如前鳃亚纲)和科(田螺科)，然后在NCBI核酸数据库中搜索下载前鳃亚纲软体动物登录的线粒体COⅠ基因的全序列，通过ClustalW2下的MultipleSequenceAlignmenttoolspage:ClustalOmega对其进行比对分析，选择序列保守区域，设计特异引物，得到该属的特异性引物对，所述的引物对的序列为：正向引物F：CTACTAATCATAAGGATATTGG，反向引物R：ATCAGCAGGTAAAATATTATC；(3)根据引物设计得到的目的片段(长约1400bp)，Tm值为48.6℃，设定PCR程序，采用该引物对需要鉴定的环棱螺个体中COⅠ基因的序列进行扩增，用凝胶电泳检测扩增效果，筛选主带大小符合预期片段长度的PCR原液送测序公司测序；(4)采用SeqMan软件优化拼接测序结果，在NCBI核酸数据库中利用BLAST对测序结果进行比对。申请人设计了一种检测环棱螺类线粒体中COⅠ基因的引物对，其序列如下所述：正向引物F：CTACTAATCATAAGGATATTGG，反向引物R：ATCAGCAGGTAAAATATTATC。上述的引物对可在环棱螺分类的分子检测中应用。本专利技术具有以下优点：1.本专利技术对设备要求不高，操作简便，适合一般实验室及新手完成相关研究。2.本专利技术获得的COⅠ基因序列较长，包含遗传信息较多，可用于该类群样本分类鉴定及系统进化研究。附图说明图1：是本专利技术采集到的环棱螺样本的照片。附图标记说明：图1中的1-30分别是不同形态的环棱螺图谱。图2：利用本专利技术的特异性引物扩增30个环棱螺样本COⅠ基因的琼脂糖电泳照片。泳道说明:泳道B1-B15是1-15#环棱螺样本COⅠ基因电泳图；泳道B16—B30是16-30#环棱螺样本COⅠ基因电泳图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进行详细说明。本专利技术的实施例是在华中农业大学水产学院农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室进行，具体实施步骤如下：(1)采集湖北省鄂州市梁子湖内鲜活环棱螺若干，从中选取部分外部形态特征较为典型，易于通过形态鉴定的个体和外部形态特征不显著难以通过形态特征鉴定的个体，共计30只样本，所述的环棱螺的样本的形态如图1所示。(2)洗刷环棱螺壳外部污泥和附着的藻类，拍照存档后用尖锐镊子勾取样本腹足部位肌肉组织。每只个体取肌肉0.2g采用SDS经典法提取其总DNA，检测纯度后稀释至约50ng/μl，作为模板DNA。(3)在NCBI核酸数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)中搜索前鳃亚纲(Prosobranchia)软体动物中已经发布的线粒体全序列物种，下载Marisacornuarietis(NC_025334.1)、Pomaceacanaliculata(NC_024586.1)、中华圆田螺(Cipangopaludinacathayensis，NC_025577.1)和湖北钉螺(Oncomelaniahupensis，NC_013073.1)四种螺类的COⅠ全序列并通过ClustalW2下的MultipleSequenceAlignmenttoolspage:ClustalO本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种环棱螺类线粒体COⅠ基因扩增引物的应用方法，其特征在于，包括下列步骤：(1)取鲜活、冷冻或用无水乙醇浸泡的环棱螺属样本个体少量肌肉组织，采用常规SDS‑碱裂解法提取每只样本总DNA，检测纯度后稀释至50ng/μl，作为模板DNA，置于‑20℃备用；同时妥善保存其外壳剩余样本组织；(2)依据形态分类资料确定环棱螺属种类的分类地位，依次鉴定到动物分类学的门、纲、亚纲和科，然后在NCBI核酸数据库中搜索下载前鳃亚纲软体动物登录的线粒体COⅠ基因的全序列，通过Clustal W2下的Multiple Sequence Alignment tools page:Clustal Omega对其进行比对分析，选择序列保守区域，设计特异引物，得到该属的特异性引物对，所述的引物对的序列如下：正向引物F：CTACTAATCATAAGGATATTGG，反向引物R：ATCAGCAGGTAAAATATTATC；(3)根据引物设计得到1400bp目的片段和Tm值48.6℃，进行PCR，采用该引物对按照标准PCR体系和程序对需要鉴定的环棱螺个体中COⅠ基因的序列进行扩增，用凝胶电泳检测扩增效果，筛选主带大小符合预期片段长度的PCR原液送测序公司测序；(4)采用SeqMan软件对优化拼接测序结果，在NCBI核酸数据库中利用BLAST对测序结果进行比对。...
【技术特征摘要】
1.一种环棱螺类线粒体COⅠ基因扩增引物的应用方法，其特征在于，包括下列步骤：(1)取鲜活、冷冻或用无水乙醇浸泡的环棱螺属样本个体少量肌肉组织，采用常规SDS-碱裂解法提取每只样本总DNA，检测纯度后稀释至50ng/μl，作为模板DNA，置于-20℃备用；同时妥善保存其外壳剩余样本组织；(2)依据形态分类资料确定环棱螺属种类的分类地位，依次鉴定到动物分类学的门、纲、亚纲和科，然后在NCBI核酸数据库中搜索下载前鳃亚纲软体动物登录的线粒体COⅠ基因的全序列，通过ClustalW2下的MultipleSequenceAlignmenttoolspage:ClustalOmega对其进行比对分析，选择序列保守区域，设计特异引物，得到该属的特异性引物对，所述的引物对的序列如下：正向...
【专利技术属性】
技术研发人员：王炬光，王卫民，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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