本发明专利技术提供了一种扩增BRCA1/2基因的多重PCR引物及一种多重PCR引物的设计方法，所述多重PCR引物包括SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:234所示的核苷酸序列。本发明专利技术还提供了一种多重PCR引物的设计方法。本发明专利技术提供的多重PCR引物可以快速的完成BRCA1/2目标序列的富集，进而进行NGS文库构建和测序，实现高度自动化、高通量的遗传性乳腺癌BRCA1/2基因检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种多重PCR引物序列，具体涉及一种扩增BRCA1/2基因的多重PCR引物及其设计方法在遗传性乳腺癌基因检测中的应用。
技术介绍
乳腺癌是我国妇女恶性肿瘤发病率排第一的癌症。根据世界卫生组织(WHO)的数据显示，2008年，中国妇女乳腺癌的发病率为21.6/10万人，新增病例达16.9万例，死亡人数为4.5万例。根据现有研究报道，约有5％～10％的乳腺癌是由BRCA1/2基因突变引起的。BRCA1/2突变在遗传性乳腺癌患者中占有很大的比例(40％～45％)，而在乳腺癌高发家族中80％的患者的BRCA1/2基因存在突变。BRCA1突变携带者一生患乳腺癌的几率大于80％，BRCA2突变携带者一生发生乳腺癌的机率为45％。对于家族遗传性乳腺癌患者及其家庭成员进行这两个基因变异的检测，能够预测癌症患病风险，做到早预防和早发现，提高治愈率和生存质量。BRCA1/2是抑癌基因，在哺乳动物中普遍存在。BRCA蛋白通常在乳腺或其它组织中表达，主要负责DNA修复。其中，BRCA1包含24个外显子，编码区长度约6K；BRCA2包含27个外显子，编码区长度约11K。目前已报道的BRCA1/2突变种类达数千种，分布在基因的各个外显子上，不存在热点突变。传统的BRCA1/2基因检测方法主要是Sanger测序，首先对几十个外显子分别进行扩增，然后每个扩增产物单独进行测序，最后再对测序结果进行分析。检测过程中存在大量的人工操作，自动化程度低，并且受限于检测通量。高通量测序技术(highthroughputsequencing)又称下一代测序(nextgenerationsequencing,NGS)或大规模并行测序(massivelyparallelsequencing,MPS)，能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，大大提高了测序的通量。同时，随着生物信息学的快速发展，高通量测序数据的分析已经实现了高度自动化。基于此，市场上涌现出越来越多的基于高通量测序的基因检测方法，包括遗传性乳腺癌BRCA1/2检测。人单倍体基因组大小为30亿碱基对左右，数据量庞大。因此，综合考虑研究目的和经济效益，一般需要在高通量测序之前先进行感兴趣的目标序列富集。目前常用的序列富集方法包括芯片杂交捕获和多重PCR扩增，核心技术主要掌握在国外大生物科技公司手上，如Roche、Agilent、LifeTechnologies等。其中，杂交捕获的特点是能够对外显子组甚至更大的目标区域进行捕获，但操作流程较复杂，需要依赖专门仪器设备；多重PCR操作简单灵活，只需要PCR仪即可进行，能在几个小时内完成目标序列富集和文库构建，适用于相对较小的目标序列富集。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种扩增BRCA1/2基因的多重PCR引物以及一种多重PCR引物的设计方法。为实现上述目的，所采取的技术方案：一种扩增BRCA1/2基因的多重PCR引物，所述多重PCR引物包括SEQIDNO:1～SEQIDNO:234所示的核苷酸序列。本专利技术提供了一种多重PCR引物的设计方法，所述设计方法包括以下步骤：(1)使用引物设计软件设计目标区域的引物库，将目标区域被分割成多个小目标区域，所述小目标区域的长度控制在200bp以内，然后针对每个小目标区域设计多对引物，构成所述引物库；(2)对步骤(1)设计的引物库中的引物进行筛选，保留特异性强、不包含简单重复序列和不存在高频SNP位点的引物；(3)对于步骤(2)中保留的引物中扩增相同小目标区域的引物，挑选引物设计软件中分值最高的一对引物；(4)在步骤(3)中获得的引物中挑选满足“引物间相互作用最小化”的原则的引物，即得所述多重PCR引物；其中所述“引物间相互作用最小化”的原则为：引物和引物之间3’末端碱基互补数不高于10，引物和引物之间整体互补率不高于75％。优选地，所述目标区域为遗传性乳腺癌基因。优选地，所述目标区域为BRCA1/2基因。优选地，所述设计软件为Primer3。本专利技术提供了上述所述的多重PCR引物在制备检测遗传性乳腺癌基因的试剂中用途。本专利技术提供了上述所述的多重PCR引物在制备检测遗传性乳腺癌基因的试剂盒中用途。本专利技术提供了一种检测遗传性乳腺癌基因的试剂，所述试剂包括上述所述的多重PCR引物。本专利技术提供了一种检测遗传性乳腺癌基因的试剂盒，所述试剂盒包括上述所述的多重PCR引物。通过熔解曲线判断单对引物能否扩增出特异的条带，如果能扩增出特异的条带，则为特异性强的引物；如果不能扩增出条带或者扩增出多条条带，则为特异性不强的引物。本专利技术的有益效果在于：1、本专利技术提供了一种多重PCR引物，与Sanger测序方法相比，基于多重PCR序列富集+NGS测序的方法能实现高度自动化、高通量的遗传性乳腺癌BRCA1/2基因检测。2、与市场上最流行、国外某大公司的BRCA1/2多重PCR序列富集方案相比：1)国外某大公司的序列富集需要分3个PCR反应体系进行，每个反应10ngDNA起始量，共需30ngDNA。本专利技术仅需在2个PCR反应体系进行，一方面减少了实验操作步骤，同时也将样本起始量降低到了20ng；2)测序数据分析比较发现，本专利技术的序列富集方法对目标区域达到了100％的富集率，同时相比国外公司的富集方法有更好的扩增均一性，能够产出更高质量、更适合后续生物信息分析的数据。因此，本专利技术在序列富集技术方面取得了重要突破，达到了国际领先水平。基于本专利技术开发出的遗传性乳腺癌基因检测具有周期短、操作简单、自动化程度高、通量高等特点，便于临床应用。可以快速的完成BRCA1/2目标序列的富集，进而进行NGS文库构建和测序，实现高度自动化、高通量的遗传性乳腺癌BRCA1/2基因检测。附图说明图1为本专利技术实施例1中qPCR扩增熔解曲线；图2为本专利技术实施例1中293T-1文库2100结果；图3为本专利技术实施例1中293T-2文库2100结果；图4为本专利技术实施例1中293T-3文库2100结果；图5为本专利技术实施例1中293T-4文库2100结果。具体实施方式为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1本专利技术的具体实施过程如下：一、多重PCR引物设计软件开发及遗传性乳腺癌BRCA1/2引物设计。多重PCR引物设计软件的输入为需要进行引物设计的基因组区域(bed文件格式，每行内容为“染色体-制表符-起始坐标-制表符-终止坐标”)，输出为设计好可在一个反应中进行扩增的多对引物，其具体实现思路如下：1)使用Primer3软件，针对每个目标区域设计出尽可能多的可用引物作为备选；2)根据引物扩增的特异性、引物是否包含简单重复序列、引物上是否存在高频的SNP位点(定义为dbSNP中较小等位基因频率在千分之五以上的位点)等条件对步骤1中设计好的引物进行过滤；3)对于满足上一步过滤条件的引物，每个目标区域挑选Primer3分值最高的一对引物，不同目标区域挑选的引物之间要满足“引物间相互作用最小化”的原则，即最小化引物3’末端及引物整体互补率。具体要求一般为引物-引物之间3’末端碱基互补数不高于10，引物-引物之间整体互补率不高于75％，该原本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种扩增BRCA1/2基因的多重PCR引物，其特征在于，所述多重PCR引物包括SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:234所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种扩增BRCA1/2基因的多重PCR引物，其特征在于，所述多重PCR引物包括SEQIDNO:1～SEQIDNO:234所示的核苷酸序列。2.一种多重PCR引物的设计方法，其特征在于，所述设计方法包括以下具体步骤：(1)使用引物设计软件设计目标区域的引物库，将目标区域分割成多个小目标区域，所述小目标区域的长度控制在200bp以内，然后针对每个小目标区域设计多对引物，构成所述引物库；(2)对步骤(1)设计的引物库中的引物进行筛选，保留特异性强、不包含简单重复序列和不存在高频SNP位点的引物；(3)对于步骤(2)中保留的引物中扩增相同小目标区域的引物，挑选引物设计软件中分值最高的一对引物；(4)在步骤(3)中获得的引物中挑选满足“引物间相互作用最小化”的原则的引物，即得所述多重PCR引物；其中...
【专利技术属性】
技术研发人员：张纪斌，王辉云，林钊，李伟琴，罗景燕，赖炳权，
申请(专利权)人：广州永诺健康科技有限公司，广州永诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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