使用固定的引物直接捕获、扩增及测序靶标DNA制造技术

某些实施方案提供用于捕获基因组片段的方法。所述方法可以包括：获得包含第一群表面结合寡核苷酸和第二群表面结合寡核苷酸的基底；将所述第一群表面结合寡核苷酸的第一成员杂交到筛选寡核苷酸，所述筛选寡核苷酸包含与所述第一成员杂交的区域以及包含基因组序列的区域；延伸所述第一群表面结合寡核苷酸的所述第一成员以产生载体结合筛选引物，所述载体结合筛选引物包含与所述基因组序列互补的序列；将所述载体结合筛选引物杂交到包含所述基因组序列的核酸片段；延伸所述载体结合筛选引物以产生包含例如在基因组中位于所述基因组序列侧翼的序列的延伸产物；以及在所述基底上扩增所述延伸产物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用固定的引物直接捕获、扩增及测序靶标DNA交叉引用本专利申请要求2010年9月24日提交的美国临时专利申请序列号61/386，390以及2011年5月11日提交的美国临时专利申请序列号61/485，062的优先权，这两份专利全文并入本文中。政府权利本专利技术根据国立卫生研究院授予的第HG000205号合同在政府支持下完成。政府享有本专利技术的某些权利。背景在许多测序方法中，尤其是重测序方法(S卩，其中对基因座进行重测序的方法)中，首先捕获靶标，然后进行测序。多种靶标捕获方法已由人们开发并与高通量测序系统集成。具体地讲，使用珠粒或微阵列的基于杂交的测定法以及使用分子倒置探针或基因组环化寡核苷酸的基于溶液中的技术可应用于捕获靶标DNA。然后制备经捕获的DNA用于测序。通常采用复杂的分子生物学方案来制备富集的DNA样品，并且在某些情况下，测序文库的产生涉及许多酶促反应、纯化步骤以及通过凝胶电泳进行的大小选择。用于靶标捕获DNA测序的样品制备过程可能是劳动密集型的，而后续样品操作会导致DNA含量的偏差并增加测序错误率。专利技术概述本文提供用于捕获和扩增核酸片段例如由RNA制备的基因组片段或cDNA的方法。还提供了用于实践该方法的试剂盒。在某些实施方案中，该方法包括:a)获得包含第一群表面结合寡核苷酸和第二群表面结合寡核苷酸的基底，其中第一和第二群表面结合寡核苷酸的成员不在基底上空间寻址 ；b)将第一群表面结合寡核苷酸的第一成员杂交到筛选寡核苷酸，该筛选寡核苷酸包含与第一成员杂交的区域以及包含基因组序列的区域；c)延伸第一群表面结合寡核苷酸的第一成员以产生载体结合筛选引物，该载体结合筛选引物包含与基因组序列互补的序列；d)将载体结合筛选引物杂交到包含基因组序列的核酸片段(如基因组片段或cDNA) ；e)延伸载体结合筛选引物以产生包含例如在基因组中位于基因组序列侧翼的序列的延伸产物；f)在基底上扩增延伸产物，例如通过使用第一和第二群表面结合寡核苷酸的未延伸成员的桥式PCR，以产生PCR产物。在某些实施方案中，该方法包括:a)获得包含第一群表面结合寡核苷酸和第二群表面结合寡核苷酸的基底，其中第一和第二群表面结合寡核苷酸不在基底上空间寻址；b)将第一群表面结合寡核苷酸的第一成员杂交到筛选寡核苷酸，该筛选寡核苷酸包含与第一成员杂交的区域以及包含基因组序列的区域；c)延伸第一群表面结合寡核苷酸的第一成员以产生载体结合筛选引物，该载体结合筛选引物包含与基因组序列互补的序列；d)将载体结合筛选引物杂交到包含基因组序列的核酸片段；e)延伸载体结合筛选引物以产生包含例如在基因组中位于基因组序列侧翼的序列的延伸产物；以及f)在基底上扩增延伸产物，例如使用桥式PCR，以产生PCR产物。取决于如何实施方法，可将衔接子在杂交前连接到基因组片段，或在延伸载体结合筛选引物后连接到延伸产物。远侧衔接子可杂交到表面结合寡核苷酸(其自身可以是通过第二群表面结合寡核苷酸的沿模板延伸而产生的延伸产物)，从而使得可以发生桥式PCR0筛选引物还可以包含测序引物结合位点，该位点可用于对PCR产物测序。上述方法通常可用于重测序方法，其中可利用参考基因座的序列，并需要在多个测试样品中对相同的基因座重测序。在该应用中，对筛选寡核苷酸进行设计以杂交到基底上的寡核苷酸，并对位于基因座侧翼的区域重测序。将基因座捕获到基底上，然后扩增，再进行测序。例如,可从由一个个体或多个个体(例如，多达10、50、100、200或1,000或更多个个体)制备的样品中捕获单个基因座或多个不同的基因座(例如，多达10、50、100、200或1,000或更多个基因座)。在某些实施方案中，该方法包括:a)获得包含第一群表面结合寡核苷酸和第二群表面结合寡核苷酸的基底，其中第一和第二群表面结合寡核苷酸随机散布在基底上并且不在空间上寻址；b)将第一群表面结合寡核苷酸的第一成员杂交到筛选寡核苷酸，该筛选寡核苷酸包含与第一成员杂交的区域以及包含基因组序列的区域；c)延伸第一群表面结合寡核苷酸的第一成员以产生载体结合筛选引物，该载体结合筛选引物包含与基因组序列互补的序列；d)将载体结合筛选引物杂交到包含基因组序列的衔接子连接片段(例如，衔接子连接基因组片段)；e)延伸载体结合筛选引物以产生包含位于基因组序列侧翼(例如在基因组中)的序列以及衔接子连接基因组片段的衔接子序列的产物；以及f)使用桥式PCR进行产物的扩增以产生PCR产物。在可供选择的实施方案中，该方法包括:a)获得包含第一群表面结合寡核苷酸和第二群表面结合寡核苷酸的基底，其中第一和第二群表面结合寡核苷酸随机散布在基底上并且不在空间上寻址；b)将第一群表面结合寡核苷酸的第一成员杂交到筛选寡核苷酸，该筛选寡核苷酸包含与第一成员杂交的区域以及包含基因组序列的区域；c)延伸第一群表面结合寡核苷酸的第一成员以产生载体结合筛选引物，该载体结合筛选引物包含与基因组序列互补的序列；e)延伸载体结合筛选引物以产生包含位于基因组序列侧翼的序列的产物；f)将双链衔接子连接到产物上以产生衔接子修饰产物；以及g)使用桥式PCR进行衔接子修饰产物的扩增以产生PCR产物。在特定情况下，该方法可进一步包括:1.将基因组片段连接到包含测序引物的位点和与第二表面结合寡核苷酸相同的核苷酸序列的衔接子，i1.将衔接子连接的基因组片段杂交到第一群表面结合寡核苷酸的第一成员，i1.延伸衔接子连接的片段所杂交到的第一群表面结合寡核苷酸的第一成员；以及iv.将延伸产物的含衔接子的末端杂交到第二载体结合多核苷酸，从而产生桥并有利于桥式PCR。附图简述以下详细说明的某些方面在结合附图阅读时可以得到最好的理解。要强调的是，根据惯例，附图的多个特征未按比例绘制。相反，为清楚起见，多个特征的尺寸被任意放大或缩小。附图中包括以下图例:附图说明图1.称为“OS-Seq”的主题方法的一个实施方案的概览。(a) OS-Seq是与IlluminaNGS平台无缝集成的靶向重测序方法。本方法需要靶标特异性寡核苷酸、测序文库和Illumina簇生成试剂盒。靶标捕获、 处理和测序在NGS系统上进行。源于各引物-探针的数据被靶向并为链特异性的。此处显示的是OS-Seq-366的中位覆盖度特征图。(b)0S_Seq的处理涉及杂交、DNA聚合酶介导的延伸和DNA变性三个步骤。第I步:将靶标特异性寡核苷酸用于将流通池引物修饰为弓丨物-探针。在11 Iumina测序系统中，将两种类型的引物(命名为C和D)固定在双端流通池。在OS-Seq中，使用寡核苷酸的复合文库将D引物的子集修饰为引物-探针。寡核苷酸具有杂交到D型流通池引物的序列。然后将杂交的寡核苷酸用作DNA聚合酶的模板，并延伸D引物。变性后，将靶标特异性引物-探针随机固定在流通池上。第2步:使用引物-探针捕获单衔接子文库中的基因组靶标。用于Illumina测序的样品制备涉及将特定的DNA衔接子添加到基因组DNA片段。这些衔接子包括测序引物和固定的流通池引物的位点。在OS-Seq中，我们使用修饰的衔接子由基因组DNA制备单衔接子文库。在高热杂交到其互补引物-探针的过程中捕获单衔接子文库中的靶标。将捕获的单衔接子文库片段用作DNA聚合酶的模板，并延伸引物-探针。变性从固定本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·梅利坎加斯，J·布恩洛斯特罗，H·P·基，
申请(专利权)人：斯坦福大学托管董事会，
类型：
国别省市：