用于扩增核酸的方法技术

本发明专利技术描述了用于扩增靶标核酸的方法，其中靶标核酸与通过5'末端固定在支持物上的捕获探针核酸杂交。用聚合酶进一步延伸杂交产物以形成双链核酸。将发夹核酸连接至此双链核酸。将此连接产物进一步扩增并测序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及将来自样品的靶标核酸与固体支持物上的捕获核酸杂交，以及涉及扩增所述杂交的核酸。
技术介绍
Illumina Solexa, AB SOLiD和Roche454的第二代测序技术通过在大量平行的模式中运作从而实现了其高通量以及相对低廉的每个测序碱基的成本。其创建了总输入DNA的许多随机片段，在珠上或者在阵列上分别扩增每个片段，在单一流通室内读取那些序列，并且能够通过将所有的单个读数与参照基因组序列匹配从而仅仅检测突变(Margulies Met al.(2005) Nature437, 376-380)。此运作方式具有的缺点是对许多基因组中不相关的部分也进行了测序。这在临床测序中尤其突出，其中通常仅有几十个至几百个基因的组才是与诊断相关的。因此，目前使用不同的技术以便在将样品引入测序仪之前选择基因组DNA中相关的部分。最常见地，是将DNA杂交至微阵列上特异性结合相关部分的捕获探针。在第二步中，将未结合的不相关部分洗掉，随后将结合的片段洗脱并准备载入测序仪(Okou D.e t al.(2007) Nat Methods4, 907-909)。通常，基因组的 0.1%_1% 的革巴标部分能够在预先选择的样品中被富集至60-80%。以此种流程，信息的处理并非最佳。在阵列上进行预先选择期间，关于DNA片段的基因组位置信息是可以利用的，因为它们特异性地结合至空间上分离的探针并且是可以被鉴别的。然而，阵列的洗脱是在单一室内进行的过程，由此所有被选择的片段又再次混合。因此，在测序后必需将所有的读数单独地与完整的参照序列进行匹配，这需要大量的计算工作。如果可以将基因组信息从阵列预先选择保留至测序反应，则会显著地降低对计算的要求。保留此信息的最简单方式是在相同表面上的同一位点进行预先选择和测序。此方法在美国申请US2009/0117573中有描述。由于目前的测序技术需要扩增每个单独的DNA片段以便在测序期间获得足够的信号，此扩增在相同的位点发生。基于桥式扩增(bridge amplification)技术的原理，描述了解决此问题的方法，其中所述桥式扩增技术是表面附着的扩增(例如Illumina的测序技术)。这可以在任何固体表面(载片、载体等)上进行，只要能够辨别出单独扩增的群落。在这些方法中，在可进行测序前使用了不同的杂交、延伸和连接的步骤。仍旧需要更加有效和快捷的方法。专利技术概述本专利技术特定的和优选的方面在所附的独立和从属权利要求中给出。从属权利要求的特征可以视情况与独立权利要求的特征以及与其它从属权利要求的特征组合，而并不仅仅如权利要求中所给出的那样。本专利技术描述了用于直接在捕获探针的位点上对捕获的靶标核酸片段进行扩增和测序的方法。在这些方法中，将发夹衔接子连接至探针-靶标双链体，其可以被用作人工桥。特异性的捕获探针则成为桥式扩增所需的单一引物。本专利技术涉及用于扩增靶标核酸的方法，所述方法包括如下步骤:a)提供具有多个核酸捕获探针的支持物，其中所述多个探针通过核酸的5’末端固定在支持物上，b)将靶标核酸与捕获核酸探针杂交以形成探针/靶标复合物，c)用聚合酶延伸捕获探针核酸，其中靶标核酸被用作捕获探针核酸延伸的模板，d)将经延伸的靶标/探针双链核酸连接至发夹核酸，其中将发夹核酸的5’末端连接至经延伸的探针的3’末端并且将发夹核酸的3’末端连接至靶标核酸的5’末端，e)使靶标核酸的3’末端结合至所述支持物上的所述多个核酸捕获探针中的另外的探针，f)通过聚合酶延伸所述另外的探针的3’末端，g)通过重复步骤e)和f)扩增步骤f)中所获得的核酸在其它特定的实施方案中，步骤c)中的聚合酶不具有末端转移酶活性或3’至5’校正外切核酸酶活性并且其中所述发夹核酸形成平端茎。例如，步骤c)中的聚合酶是Pfu (激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)) DNA 聚合酶。在特定的实施方案中，步骤c)中的聚合酶具有3’末端转移酶活性，导致在双链核酸的3’末端的突出端，并且其中所述发夹核酸具有5’突出端，与双链核酸的3’互补。例如，步骤c)中的聚合酶是Taq (水生栖热菌(Thermophilus aquaticus)) DNA聚合酶，生成一个腺嘌呤的3’突出端，并且其中发夹的5’突出端是一个胸腺嘧啶核苷。在本专利技术另外的优选实施方案中步骤c)中的聚合酶是Klenow聚合酶。此酶可在存在单一类型的核苷酸时使用，沿着捕获的片段序列生成一系列相同的核苷酸。在另外的特别 优选的实施方案中，所述单一类型的核苷酸是dTTP。在另外的优选实施方案中，步骤d)的将经延伸的靶标/探针双链核酸连接至发夹核酸是在连接反应中存在PEG8000时进行的。在特别优选的实施方案中，步骤d)的将经延伸的靶标/探针双链核酸连接至发夹核酸是在连接反应中存在5%的PEG8000 (40w/v)时进行的。在另外的特定实施方案中，用具有3’末端转移酶活性的酶进一步处理双链平端核苷酸。在本专利技术方法特定的实施方案中，靶标核酸是DNA.在本专利技术方法另外的特定实施方案中，发夹核酸在其环中包含用于罕见的限制性内切核酸酶的序列。在另外的特定实施方案中，支持物是平面支持物(planar support),包含不同的区别(distinct)区域，每个区域包含多个不同的探针。在本专利技术方法特定的实施方案中，支持物是微载体，其中所述微载体包含多个一种核酸捕获探针(a plurality of one nucleic acid capture probe)。本文中的微载体任选包含可检测的标记，其中所述可检测的标记限定了附着至微载体的捕获探针的序列。在本专利技术方法另外的特定实施方案中，在步骤g)中的扩增之后进行相应于靶标核酸的核酸序列确定，以及还包括将确定的序列与平面支持物上的区域或微载体上的标记相关联的步骤。附图简述本专利技术上文以及其它的特性、特征和优势将通过如下的详细描述结合附图而显现，其通过实施例的方式说明了本专利技术的原理。本说明书仅仅是为了进行举例说明，而并非是要局限本专利技术的范围。如下所引用的参考图是指所附的图片。附图说明图1显示了本专利技术所描述的方法的实施方案。A)靶标DNA的杂交；B)捕获探针的延伸；C)发夹的连接；D)变性与重退火；E)桥式扩增；F)线性化;G)序列确定。图2显示了图1的C部分所描述的方法步骤实施方案的两个实施例。左半部分说明了用不具有末端转移酶活性或具有3’至5’外切核酸酶活性的酶所进行的延伸，其中生成了平端双链DNA用于与平端发夹核酸连接。右半部分说明了用具有3’末端转移酶活性的酶如Taq DNA聚合酶所进行的延伸，其中产生了具有单一腺嘌呤3’突出端的双链用于与具有单一 5’胸腺嘧啶核苷突出端的发夹核酸连接图3显示了比较实例，其中对于将发夹连接至单链DNA的连接效率(左半部分)和将平端发夹连接至平端双链DNA的连接效率进行了比较。图4说明了使用Klenow聚合酶和单一类型核苷酸的引物延伸实施方案。图5显示了在与荧光标记的发夹连接之后的荧光测量，其中以不同的核苷酸使用Klenow聚合酶。图6显示了在用dATP或dTTP进行末端修复之后用dNTP_C*混合物所获得的实验结果，表明4nt的突出端完全是由dATP或dTTP所填充的。获得了参照(用dNTP-C本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.09.01 EP 10174857.21.用于扩增靶标核酸的方法，所述方法包括如下步骤: a)提供具有多个核酸捕获探针的支持物，其中所述多个探针通过核酸的5’末端固定在支持物上， b)将靶标核酸与捕获核酸探针杂交以形成探针/靶标复合物， c)用聚合酶延伸捕获探针核酸，其中靶标核酸被用作捕获探针核酸延伸的模板， d)将经延伸的靶标/探针双链核酸连接至发夹核酸，其中将发夹核酸的5’末端连接至经延伸的探针的3’末端并且将发夹核酸的3’末端连接至靶标核酸的5’末端， e)使靶标核酸的3’末端结合至所述支持物上的所述多个核酸捕获探针中的另外的探针， f)通过聚合酶延伸所述另外的探针的3’末端， g)通过重复步骤e)和f)扩增步骤f)中所获得的核酸。2.权利要求1的方法，其中步骤c)的聚合酶具有3’至5’的校正外切核酸酶活性并且其中所述发夹核酸形成平端茎。3.权利要求1或2的方法,其中步骤c)的聚合酶是Pfu(激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)) DNA 聚合酶。4.权利要求1的方法，其中步骤c)的聚合酶具有3’末端转移酶活性，导致在双链核酸的3’末端的突出端，并且其中所述发夹核酸具有5’突出端，与双链核酸的3’互补。5.权利要求1或3的方法，其中步骤c)的聚合酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·M·费特斯马，M·J·奥弗戴克，A·范德斯托尔佩，P·J·范德扎格，
申请(专利权)人：皇家飞利浦电子股份有限公司，
类型：
国别省市：