用于核酸扩增的样品制备制造技术

本发明专利技术涉及用于制备用于随后核酸(例如DNA)扩增的样品的方法，该方法比现有的方法更简单进行。

Sample preparation for nucleic acid amplification

The present invention relates to a method for preparing a sample for subsequent nucleic acid (e.g. DNA) amplification, which is simpler than the existing method.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利技术的
本专利技术涉及用于制备用于随后核酸(例如DNA)扩增的样品的方法，该方法比现有的方法更容易进行。特别是，本专利技术涉及其中不需要在扩增之前从样品纯化核酸(例如DNA)的方法。专利技术背景常规的DNA扩增方法通常需要在扩增步骤之前获得纯化的DNA。纯化过程通常需要酶消化或裂解细胞样品中的细胞，随后是一个或更多个分离步骤从细胞碎片分离出DNA，这可包括一个或更多个洗涤步骤和将纯化的DNA最终洗脱进管中准备用于在扩增过程(诸如PCR)中使用。该过程通常花费30分钟以上，通常40分钟或更多。最近，Sigma开发了所谓的‘Extract-N-AmpTM血液PCR试剂盒’，其含有从全血提取宿主基因组DNA并通过PCR扩增感兴趣的靶必需的试剂。该提取系统降低了对于纯化、有机提取、离心、加热、过滤或乙醇沉淀的需要。试剂盒还包括PCR预混合物，尤其被配制用于直接从提取物扩增。该制品使用基于热启动(HotStart)的抗体用于特异扩增。通过简单地添加提取溶液(其似乎是氢氧化钾)和在室温孵育持续5分钟，从10μl全血提取基因组DNA。在PCR之前，将中和溶液添加到提取物中抵消抑制物质。然后，将一部分的DNA提取物添加到专门配制的PCR混合物中。本专利技术的目标是提供在扩增之前不需要纯化DNA的样品制备方法。优选地，那些方法仅需要简单的试剂，这降低了进行制备的人员的时间和成本负担。专利技术概述在本专利技术的一个实施方案中，提供了制备用于文库扩增和随后扩增的样品的方法，所述方法包括以下的步骤：(a)提供含有核酸的细胞样品；(b)裂解样品的细胞以从细胞样品的细胞内释放核酸，从而形成裂解物；和(c)从裂解的样品扩增核酸；其中在开始扩增步骤(c)之前，不从裂解的样品纯化核酸。优选地，核酸是DNA。优选地，样品是临床或非临床样品。优选地，样品是血液样品。优选地，血液样品是全血样品。在一个实施方案中，样品取自培养物。在另一个实施方案中，样品取自微生物培养物(例如，血液培养物)。优选地，样品是非血液样品，诸如组织样品(例如肿瘤、活体组织切片)、抽出物等等。优选地，裂解试剂是水，优选地纯化水/蒸馏水。优选地，裂解试剂不是水。实例可以包括去污剂、酸、碱、酶。优选地，样品和裂解试剂被混合在一起以实现更均匀的分布。任选地，还将酶添加到裂解物以便于破坏DNA结构。优选地，酶是蛋白酶K。任选地，如果需要，在用裂解试剂裂解细胞之后存在中和步骤以使裂解试剂失活。优选地，该中和步骤在扩增步骤(c)之前。在一些方面，中和步骤可被看作孵育期的一部分。当标签化将作为扩增过程的一部分被进行时，还可以进行同一或另外的中和步骤，以便中和裂解物中可能干扰随后的扩增步骤的任何其他剂，诸如蛋白酶K。任选地，在合并样品和裂解试剂之后，存在孵育期。孵育期应足以允许裂解样品中的细胞的部分，优选地大部分或基本全部或全部，包括其细胞膜(和优选地包括核膜)，以使得细胞的核酸(例如DNA)变得可用于合适的扩增。尽管孵育可以发生在高于室温的温度，孵育不必意味着使用升高的温度。孵育可以发生在室温或接近室温，或在低于室温。孵育时间可以范围从几秒钟例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60秒钟到几分钟例如约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6,5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10分钟。取决于样品和/或裂解试剂，可以需要更长的孵育期，诸如约20、30、40、50、60、70、80、90分钟。包括以上提到的任一时间的组合分别作为下限和上限的孵育时间的范围(例如约0.5-10分钟、约1-5分钟、约2-5分钟、约1-8分钟等等)也是允许的。在本专利技术的一个方面，裂解样品和扩增包含在其中的核酸的步骤在单锅反应(singlepotreaction)中进行。从裂解细胞形成的裂解物可以包含当细胞被裂解时产生的所有内容物和细胞膜的碎片等等，诸如例如细胞质和其组分。在本专利技术的上下文中，裂解物还可以被看作是裂解的细胞的内容物，排除诸如以下的物质：细胞膜碎片和较大的细胞碎片(诸如细胞器等等(例如在裂解步骤期间免于被裂解的))。换句话说，裂解物可以包含细胞的胞质溶胶连同脂质、蛋白质和核酸。术语“在开始扩增步骤(c)之前，不从裂解的样品纯化核酸”，意指在起始扩增过程之前，核酸(例如DNA)不被从裂解物分离或分开(扩增过程自身当然可以包括纯化核酸的步骤作为扩增过程的一部分)。然而，这不意指限制在裂解后和在扩增前进行的另外的步骤以改变或修饰核酸(例如DNA)或其三级结构，以便扩增过程可以成功地进行。在本专利技术的一个方面，在扩增步骤之前，进行裂解物中DNA的量的定量。在本专利技术的另外的实施方案中，扩增的DNA被测序以确定其序列。这可通过本领域已知的任何方法完成。优选地，其通过高通量测序，诸如合成测序方案被测序。附图简述图1阐明制备用于靶向DNA扩增的全血样品的方法的实例的流程图；图2示出对于通过根据图1的方法制备的全血样品的靶向DNA扩增产生的扩增子，通过过滤的聚簇的绘图；图3A和3B分别示出来自对通过用水稀释制备的全血样品进行的靶向DNA扩增测定的扩增子尺寸的绘图和GC含量百分比的绘图；图4示出图3A和3B的靶向DNA扩增测定的测序量度的数据表；图5示出从通过靶向DNA扩增直接从全血样品产生的扩增子产生的聚簇的板图(panel)；图6阐明制备用于构建标签化的DNA文库(Nextera)的全血样品的方法的实例的流程图；图7A和7B分别示出根据图6的方法制备的标签化的DNA文库的每条染色体测序深度的柱形图和尺寸分布的绘图；图8阐明制备用于靶向扩增和随后测序的FFPE样品的方法的实例的流程图；图9A示出根据图8的方法，从自结肠肿瘤FFPE样品制备的DNA产生的扩增子的Q得分量度的柱形图和测序量度的数据表；图9B示出使用QiaAmpDNA纯化试剂盒，从自结肠肿瘤FFPE样品制备的DNA产生的扩增子的Q得分量度的柱形图和测序量度的数据表；图10A和10B示出图9A和9B的QiaAmp制备的DNA和QuickExtract制备的DNA的测序量度的数据表和扩增子聚簇的绘图；和图11A和11B分别示出来自FFPE切片的直接靶向扩增(无孵育)的扩增子尺寸的绘图和GC含量百分比的绘图；和图12阐明从干燥的血斑测序的方法的实例；图13A(测序量度的数据表)和13B(扩增子尺寸的绘图和GC含量百分比的绘图)示出图12的测序结果；和图14阐明从血斑标签化和测序的方法的实例，其中上图包括在水中的洗涤步骤，且下图省略在水中的洗涤步骤；和图15A(测序量度的数据表)和15B(示出文库插入物尺寸(上部)和染色体覆盖度(下部)的图)示出图14的测序结果。图16示出根据图6中阐明的工作流程进行的，制备用于构建标签化DNA文库(Nextera)的全血样品的样品制备方法的测序量度的数据表(上部)和示出每条染色体测序深度的图(下图)。图17示出根据图6中阐明的工作流程进行的(但对于标签化步骤使用基于珠的标签化)制备用于构建标签化DNA文库(Nextera)的全血样品的样品制备方法的测序量度的数据表(上部)和每条染色体测序深度的图(下部)。图18示出通过在水中冲洗干燥的血斑随后标签化(Nextera本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备用于文库扩增和随后扩增的样品的方法，所述方法包括以下的步骤：(a)提供含有核酸的细胞样品；(b)用裂解试剂裂解所述样品的细胞以从所述细胞样品的所述细胞内释放核酸，从而形成裂解物；和(c)从所裂解的样品扩增核酸；其中在开始扩增步骤(c)之前，不从所述裂解物纯化核酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.09 GB 1410196.8;2014.07.09 GB 1412207.11.一种制备用于文库扩增和随后扩增的样品的方法，所述方法包括以下的步骤：(a)提供含有核酸的细胞样品；(b)用裂解试剂裂解所述样品的细胞以从所述细胞样品的所述细胞内释放核酸，从而形成裂解物；和(c)从所裂解的样品扩增核酸；其中在开始扩增步骤(c)之前，不从所述裂解物纯化核酸。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸是DNA。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述样品是血液样品，优选地全血样品。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述样品是干燥的血液样品。5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述样品是非血液样品，诸如组织样品(例如肿瘤、活体组织切片)、抽出物等等。6.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述裂解试剂是水，优选地纯化水/蒸馏水。7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述裂解试剂不是水，而是诸如去污剂、碱、酸和/或酶。8.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述样品和裂解试剂在被合并后混合在一起。9.根据任一前述权利要求所述的方法，其中还向所述裂解物添加酶以便破坏DNA结构。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述酶是蛋白酶K。11.根据任一前述权利要求所述的方法，其中如果需要，在扩增步骤(c)之前存在任选的中和步骤以使所述裂解试剂失活。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述中和步骤经由中和剂或经由加热进行。13.根据任一前述权利要求所述的方法，其中在合并所述样品和所述裂解试剂之后且在扩增步骤之前，存在孵育期。14.根据任一前述权利要求所述的方法，其中裂解所述样品的步骤和扩增包含在其中的核酸的步骤在单锅反应中进行。15.根据任一前述权利要求所述的方法，其中从合并所述样品和裂解试剂到开始扩增过程所花费的时间少于约20分钟，优选地少于约15分钟，优选地少于约10分钟，优选地少于约5分钟，优选地少于约4分钟，优选地少于约3分钟，优选地少于约2分钟，优选地在约1-5分钟之间，优选地在约2-4分钟之间。16.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述扩增过程包括PCR。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述扩增过程包括标签化。18.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述扩增的DNA被测序以确定其序列。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述测序方案是高通量测序，诸如合成测序方案。20.一种制备用于文库扩增和随后测序的样品的方法，所述方法包括以下的步骤：(a)提供含有核酸的细胞样品；(b)用裂解试剂裂解所述样品的细胞以从所述细胞样品的所述细胞内释放核酸，从而形成裂解物；和(c)使所述裂解物中的所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：路易斯·弗雷泽，保拉·科克冈萨雷斯，安德鲁·斯拉特，
申请(专利权)人：伊鲁米纳剑桥有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB