使用多核苷酸改善流通池的接种效率的方法、组合物和试剂盒技术

本公开涉及使用多核苷酸改善流通池的接种效率的方法、组合物和试剂盒，以及它们的应用，包括用于测序。包括用于测序。包括用于测序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用多核苷酸改善流通池的接种效率的方法、组合物和试剂盒
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本专利申请要求2021年1月29日提交的美国临时申请序列号63/143,680的优先权，其公开内容以引用方式并入本文。


[0003]本公开涉及用于使用多核苷酸改善流通池的接种效率的方法、组合物和试剂盒，以及它们的应用，包括用于测序。

技术介绍

[0004]DNA测序处于快速变化的时期，其中毛细管测序不再是大多数超高通量应用的选择技术。利用流通池中引发的合成以同时获得数百万个不同DNA模板的序列的新一代仪器已经改变了该领域。
[0005]下一代测序(NGS)平台通常采用核酸片段文库。核酸片段文库可使用基于PCR的方法或基于转座子的方法制备。在后一种情况下，游离的转座子末端和修饰的转座酶用于形成转座体复合物。然后该转座体复合物用于将核酸片段化并加标签，生成准备好用于测序仪的片段标签化文库。转座体复合物可以在溶液中形成或附着于固体载体，如小珠。为了在流通池中使用结合到固体载体(例如，转座体小珠)的转座体复合物，该转座体复合物的核酸组分必须被释放，然后接种在流通池表面上。通常，这样做的手段是通过使用加热或过量使用的竞争性结合剂(例如，生物素)。然而，加热引起流通池中的扩散增加，其将破坏所形成的簇的空间共定位。

技术实现思路

[0006]本公开提供了解决流通池的低接种效率问题的组合物、方法和试剂盒。特别地，本公开的组合物、方法和试剂盒提供了通过使用排除扩增(ExAmp)以使用溶液中的引物(
″
溶液引物
″
)将转座的多核苷酸复制到小珠上，从而将扩增的核酸从该小珠释放到种子流通池。更具体地说，通过使用该溶液引物的链侵入引起拷贝的链置换到溶液中，从而有效地将它们从该小珠中释放出来，并且促进该流通池的接种。在另外的实施方案中，小珠还可以包含结合的扩增引物，以便增强自该小珠扩增的核酸的扩增和置换。在其他实施方案中，该流通池的接种效率可通过使用流通池上线性扩增和浅层液体变性/接种工作流来改善或进一步改善。
[0007]在具体实施方案中，本公开提供了使用从小珠释放的多核苷酸接种流通池的方法，该方法包括：(i)将第一引物退火至结合到小珠的多核苷酸链，其中该多核苷酸链的5
′
端使用第一附接剂结合到小珠，其中该多核苷酸链包含含有与该第一引物的序列互补的序列的接头，并且其中该第一引物在溶液中；(ii)使用聚合酶从该第一引物延伸以形成双链多核苷酸产物；(iii)通过使用额外量的该第一引物和重组酶进行该双链多核苷酸产物的
引物侵入；(iv)通过使用聚合酶从步骤(iii)中的该额外的第一引物延伸，从该小珠置换并且释放步骤(ii)的该双链多核苷酸产物的链；(v)通过使用第二附接剂将步骤(iv)中释放的该链附接到流通池的该表面来接种流通池；并且任选地，重复步骤(iii)至(v)多次。在另外的实施方案中，该小珠的形状通常为球形或通常为卵形。在另一个实施方案中，该小珠具有为约500nm、1μM、1.1μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、1.6μM、1.7μM、1.8μM、1.9μM、2μM、2.1μM、2.2μM、2.3μM、2.4μM、2.5μM、2.6μM、2.7μM、2.8μM、2.9μM、3μM、3.1μM、3.2μM、3.3μM、3.4μM、3.5μM、3.6μM、3.7μM、3.8μM、3.9μM、4μM、4.1μM、4.2μM、4.3μM、4.4μM、4.5μM、4.6μM、4.7μM、4.8μM、4.9μM、5.0μM、5.1μM、5.2μM、5.3μM、5.4μM、5.5μM、5.6μM、5.7μM、5.8μM、5.9μM、6μM、6.1μM、6.2μM、6.3μM、6.4μM、6.5μM、6.6μM、6.7μM、6.8μM、6.9μM、7μM、7.1μM、7.2μM、7.3μM、7.4μM、7.5μM、7.6μM、7.7μM、7.8μM、7.9μM、8μM、8.1μM、8.2μM、8.3μM、8.4μM、8.5μM、8.6μM、8.7μM、8.8μM、8.9μM、9.0μM、9.1μM、9.2μM、9.3μM、9.4μM、9.5μM、9.6μM、9.7μM、9.8μM、9.9μM、10μM，或包括前述任何两个距离或在前述任何两个距离之间的范围的直径。在又另一个实施方案中，该小珠具有为约500nm、1μM、1.1μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、1.6μM、1.7μM、1.8μM、1.9μM、2μM、2.1μM、2.2μM、2.3μM、2.4μM、2.5μM、2.6μM、2.7μM、2.8μM、2.9μM、3μM、3.1μM、3.2μM、3.3μM、3.4μM、3.5μM，或包括前述任何两个距离或在前述任何两个距离之间的范围的直径。在某个实施方案中，该小珠由聚合物材料、二氧化硅材料、氧化锆材料或超顺磁性材料组成。在另外的实施方案中，该小珠由超顺磁性材料组成。在又另外的实施方案中，该小珠用选自生物素；链霉抗生物素蛋白；胺基；羧基；环氧基；甲苯磺酰基；抗体或抗原；多组氨酸标签或包含金属离子的载体；和受体或配体的涂层或层官能化。在具体实施方案中，该小珠不固定在该流通池的一个或多个表面上。
[0008]在另选实施方案中，使用附接剂将该小珠固定在流通池的一个或多个表面上。在另一个实施方案中，该附接剂是两个互补序列之间的生物素/链霉抗生物素蛋白连接或碱基配对。在又另一个实施方案中，结合到该小珠的该多核苷酸链包含基因组DNA。在另外的实施方案中，结合到该小珠的该多核苷酸链包含长模板DNA。在又另外的实施方案中，结合到该小珠的该多核苷酸链包含来自受试者的样品的DNA。在某个实施方案中，该受试者的样品是尿液、血液、唾液、组织、血清、血浆、痰、胆汁、排泄物、毛发、皮肤和/或原代细胞样品。在另一个实施方案中，通过使用连接到该小珠的转座体，将该多核苷酸链片段标签化并且结合到该小珠。在又另一个实施方案中，连接到该小珠的该转座体包含转座酶Tn5或其突变体或变体。在另外的实施方案中，该多核苷酸链包含通过第一附接剂结合到小珠的序列的第一部分和通过使用连接酶和连接到该小珠的转座体进行片段标签化并且连接到该序列的第一部分的序列的第二部分。在又另外的实施方案中，连接到该小珠的该转座体包含转座酶Tn5或其突变体或变体。在另一个实施方案中，该序列的该第一部分包含一个或多个条形码或索引序列、一个或多个通用引物序列和/或嵌合末端序列。在又另一个实施方案中，该序列的该第一部分包含一个或多个条形码或索引序列、一个或多个通用引物序列和嵌合末端序列，并且其中该嵌合末端序列位于该序列的该第一部分的3
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端。在某个实施方案中，该接头包含互补的并且可与该多核苷酸链的该序列的该第一部分杂交的第一序列，并且其中该接头包含不互补的并且不能与该多核苷酸链的该序列的该第一部分杂交的第二序列。在另一个实施方案中，该接头的该第二序列包含与该第一引物的该序列互补的序列。在又另一个实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用从小珠释放的多核苷酸接种流通池的方法，所述方法包括：(i)将第一引物退火至结合到小珠的多核苷酸链，其中所述多核苷酸链的5
′
端使用第一附接剂结合到所述小珠，其中所述多核苷酸链包含含有与所述第一引物的序列互补的序列的接头，并且其中所述第一引物在溶液中；(ii)使用聚合酶从所述第一引物延伸以形成双链多核苷酸产物；(iii)通过使用额外量的所述第一引物和重组酶进行所述双链多核苷酸产物的引物侵入；(iv)通过使用聚合酶从步骤(iii)中的所述额外的第一引物延伸，从所述小珠置换并且释放步骤(ii)的所述双链多核苷酸产物的链；(v)通过使用第二附接剂将步骤(iv)中释放的所述链附接到流通池的所述表面来接种流通池；并且任选地，重复步骤(iii)至(v)多次。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述小珠的形状通常为球形或通常为卵形。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述小珠具有为约500nm、1μM、1.1μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、1.6μM、1.7μM、1.8μM、1.9μM、2μM、2.1μM、2.2μM、2.3μM、2.4μM、2.5μM、2.6μM、2.7μM、2.8μM、2.9μM、3μM、3.1μM、3.2μM、3.3μM、3.4μM、3.5μM、3.6μM、3.7μM、3.8μM、3.9μM、4μM、4.1μM、4.2μM、4.3μM、4.4μM、4.5μM、4.6μM、4.7μM、4.8μM、4.9μM、5.0μM、5.1μM、5.2μM、5.3μM、5.4μM、5.5μM、5.6μM、5.7μM、5.8μM、5.9μM、6μM、6.1μM、6.2μM、6.3μM、6.4μM、6.5μM、6.6μM、6.7μM、6.8μM、6.9μM、7μM、7.1μM、7.2μM、7.3μM、7.4μM、7.5μM、7.6μM、7.7μM、7.8μM、7.9μM、8μM、8.1μM、8.2μM、8.3μM、8.4μM、8.5μM、8.6μM、8.7μM、8.8μM、8.9μM、9.0μM、9.1μM、9.2μM、9.3μM、9.4μM、9.5μM、9.6μM、9.7μM、9.8μM、9.9μM、10μM，或包括前述任何两个距离或在前述任何两个距离之间的范围的直径。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述小珠具有为约500nm、1μM、1.1μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、1.6μM、1.7μM、1.8μM、1.9μM、2μM、2.1μM、2.2μM、2.3μM、2.4μM、2.5μM、2.6μM、2.7μM、2.8μM、2.9μM、3μM、3.1μM、3.2μM、3.3μM、3.4μM、3.5μM，或包括前述任何两个距离或在前述任何两个距离之间的范围的直径。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述小珠由聚合物材料、二氧化硅材料、氧化锆材料或超顺磁性材料组成。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述小珠由超顺磁性材料组成。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述小珠用选自生物素；链霉抗生物素蛋白；胺基；羧基；环氧基；甲苯磺酰基；抗体或抗原；多组氨酸标签或包含金属离子的载体；和受体或配体的涂层或层官能化。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述小珠不固定在所述流通池的一个或多个表面上。9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中使用附接剂将所述小珠固定在所述流通池的一个或多个表面上。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述附接剂是两个互补序列之间的生物素/链霉抗生物素蛋白连接或碱基配对。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中结合到所述小珠的所述多核苷酸链
包含基因组DNA。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中结合到所述小珠的所述多核苷酸链包含长模板DNA。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中结合到所述小珠的所述多核苷酸链包含来自受试者样品的DNA。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述受试者的样品是尿液、血液、唾液、组织、血清、血浆、痰、胆汁、排泄物、毛发、皮肤和/或原代细胞样品。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过使用连接到所述小珠的转座体，将所述多核苷酸链片段标签化并且结合到所述小珠。16.根据权利要求15所述的方法，其中连接到所述小珠的所述转座体包含转座酶Tn5或其突变体或变体。17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸链包含通过第一附接剂结合到小珠的序列的第一部分和通过使用连接酶和连接到所述小珠的转座体进行片段标签化并且连接到序列的所述第一部分的序列的第二部分。18.根据权利要求17所述的方法，其中连接到所述小珠的所述转座体包含转座酶Tn5或其突变体或变体。19.根据权利要求17或权利要求18所述的方法，其中所述序列的所述第一部分包含一个或多个条形码或索引序列、一个或多个通用引物序列和/或嵌合末端序列。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述序列的所述第一部分包含一个或多个条形码或索引序列、一个或多个通用引物序列和嵌合末端序列，并且其中所述嵌合末端序列位于所述序列的所述第一部分的3
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端。21.根据权利要求17至20中任一项所述的方法，其中所述接头包含互补的并且可与所述多核苷酸链的所述序列的所述第一部分杂交的第一序列，并且其中所述接头包含不互补的并且不能与所述多核苷酸链的所述序列的所述第一部分杂交的第二序列。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述接头的所述第二序列包含与所述第一引物的所述序列互补的序列。23.根据权利要求17至22中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸链的序列的所述第二部分包含gDNA。24.根据权利要求17至23中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸链的序列的所述第二部分包含长模板DNA。25.根据权利要求17至24中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸链的序列的所述第二部分包含来自受试者的样品的DNA。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述受试者的样品是尿液、血液、唾液、组织、血清、血浆、痰、胆汁、排泄物、毛发、皮肤和/或原代细胞样品。27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一附接剂和第二附接剂选自生物素/链霉抗生物素蛋白连接、共价键、两个互补序列之间的碱基配对、结合抗原的抗体、结合另一抗体的抗体、结合包含金属离子的载体的多组氨酸标签和结合配体的受体。28.根据权利要求27所述的方法，其中所述第一附接剂是生物素/链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白连接，并且其中所述第二附接剂是两个互补序列之间的碱基配对。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述多核苷酸链在5
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端包含生物素残基，并且所述小珠包含链霉抗生物素蛋白残基。30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一引物具有序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述第一引物具有所述序列SEQ ID NO：2。32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用DNA聚合酶从所述第一引物延伸所述序列。33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法提供用于所述多核苷酸链的线性拷贝。34.一种用从小珠释放的多核苷酸接种流通池的方法，所述方法包括：(i)提供包含结合到小珠的多核苷酸链的小珠，其中所述多核苷酸链的5
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端使用第一附接剂结合到所述小珠，并且其中所述多核苷酸链包含含有与第一引物的所述序列互补的序列的接头，并且其中所述小珠还包含结合的第一扩增引物，其中所述第一扩增引物通过第三附接剂结合到所述小珠，其中所述第一扩增引物具有与所述第一引物的所述序列不同并且不互补的序列，并且其中所述多核苷酸链包含与所述第一扩增引物互补的序列；(ii)将所述第一引物退火至结合到小珠的所述多核苷酸链，其中所述第一引物在溶液中；(iii)使用聚合酶从所述第一引物延伸以形成双链多核苷酸产物；(iv)通过使用额外量的所述第一引物和/或所述第一扩增引物和重组酶进行所述双链多核苷酸产物的引物侵入；(v)通过使用聚合酶从步骤(iv)中的所述额外的第一引物和/或所述第一扩增引物延伸，从所述小珠置换并且释放步骤(iii)的所述双链多核苷酸产物的链；(vi)通过使用第二附接剂将步骤(v)中释放的所述链附...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴怡萱，F，
申请(专利权)人：伊鲁米纳剑桥有限公司，
类型：发明
国别省市：