甲醛重交联在制造技术

本发明专利技术提供了一种甲醛重交联在

【技术实现步骤摘要】
甲醛重交联在CUT
＆
Tag技术建库中的应用


[0001]本专利技术属于生物

。
具体地，涉及甲醛重交联在
CUT
＆
Tag
技术建库中的应用
。

技术介绍

[0002]在胚胎的正常发育过程中，携带相同遗传物质的受精卵会分化成不同形态的细胞，最终形成具有不同组织和器官的完整生物体
。
研究表明，这种不涉及遗传物质改变的分化是通过表观遗传调控实现的
。
表观遗传调控通常包括基因调控和染色质调控，这些调控过程与蛋白质
‑
DNA
相互作用息息相关
。
由表观遗传学控制的基因表达模式的破坏会导致自身免疫性疾病
、
癌症等各种疾病
。
因此，研究蛋白质
‑
DNA
之间的相互作用对于理解疾病发生具有至关重要的意义
。
[0003]目前，研究蛋白质
‑
DNA
相互作用的方法主要有：染色质免疫共沉淀
(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)、CUT
＆
RUN、
和
CUT
＆
Tag((Cleavage Under Targets and Tagmentation))
技术
。
其中，
CUT
＆
Tag
技术使用细胞或细胞核进行实验，无需交联固定细胞
(
或采用
0.1
～
0.2
％甲醛
、2
～
3min
的轻交联
)
，通过
protein A/protein G
‑
Tn5
转座酶实现靶向打断
。
具有细胞需求量少
(1
～
10
万细胞
)、
耗时短
(8
～
10
小时
)、
背景噪音低
、
实验简单等特点
。
[0004]然而，在大量实践中，科研工作者发现
CUT
＆
Tag
技术存在局限性
。
对于一些与
DNA
的结合具有动态性的
DNA
结合蛋白的相互作用检测，
CUT
＆
Tag
技术中不交联或轻交联
(0.1
％～
0.2
％甲醛
)
的方法，难以真实反映实验样本的客观情况
。
此外也存在结合位点信号强度较弱
、
背景较高的问题
。
[0005]综上所述，
CUT
＆
Tag
技术面临着巨大挑战
。
如何使
CUT
＆
Tag
适用于大部分蛋白质
‑
DNA
相互作用，同时保持
CUT
＆
Tag
技术简单快捷的特点，是亟待解决的问题
。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种甲醛重交联在
CUT
＆
Tag
技术建库中的应用
。
[0007]本专利技术的目的在于还提供一种靶蛋白固定及其
DNA
结合图谱鉴定的建库方法
。
[0008]本专利技术的目的在于还提供一种针对与
DNA
结合力弱或与
DNA
的结合具有高度动态性的
DNA
结合蛋白的
DNA
结合图谱鉴定的建库方法
。
[0009]在本专利技术的第一方面，提供了一种构建核酸文库的方法，包括：
[0010](S1)
提供一细胞样本；
[0011](S2)
通过终浓度
C1(v/v)
的交联剂溶液，固定化处理上述细胞样本
t1
时间
(min)
，其中固定化处理积分
I1
＝
C1*t1
，
I1≥2.5
，获得一未通透化的细胞样本；
[0012](S3)
对所述未通透化的细胞样本进行通透化处理，获得经通透化处理的细胞样本；
[0013](S4)
洗涤上述经通透化处理的细胞样本，获得经洗涤的细胞混合物；
[0014](S5)
将上述细胞混合物与已经预处理的磁珠混合，获得细胞
‑
磁珠复合物；
[0015](S6)
利用一抗处理上述的细胞
‑
磁珠结合物，获得一抗
‑
细胞
‑
磁珠复合物；
[0016](S7)
利用二抗处理上述一抗
‑
细胞
‑
磁珠复合物，获得二抗
‑
一抗
‑
细胞
‑
磁珠复合物；
[0017](S8)
利用转座酶处理上述二抗
‑
一抗
‑
细胞
‑
磁珠复合物，进行片段化反应，形成
DNA
片段；
[0018](S9)
终止反应并解交联，获得反应终止产物；和
[0019](S10)
分离
、
纯化
、
扩增上述反应终止产物中的
DNA
片段，制备核酸文库
。
[0020]在另一优选例中，
(S1)
中，所述细胞包括动物细胞，较佳地为哺乳动物细胞，更佳地为仓鼠细胞
、
人类细胞或小鼠细胞
。
[0021]在另一优选例中，
(S1)
中，所述细胞样本中的细胞密度为1×
103～5×
106个
/mL。
[0022]在另一优选例中，
(S2)
中，
C1
为
0.5
％～5％
(v/v)
；较佳地为1％～3％
(v/v)。
[0023]在另一优选例中，
(S2)
中，
t1
为5～
60min
；较佳地为
10
～
20min。
[0024]在另一优选例中，
(S2)
中，
I1
为
2.5
～
300
；较佳地
I1≥10。
[0025]在另一优选例中，
(S2)
中，所述固定化处理为充分固定化处理，指所有或基本上所有的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种构建核酸文库的方法，其特征在于，包括：
(S1)
提供一细胞样本；
(S2)
通过终浓度
C1(v/v)
的交联剂溶液，固定化处理上述细胞样本
t1
时间
(min)
，其中固定化处理积分
I1
＝
C1*t1
，
I1≥2.5
，获得一未通透化的细胞样本；
(S3)
对所述未通透化的细胞样本进行通透化处理，获得经通透化处理的细胞样本；
(S4)
洗涤上述经通透化处理的细胞样本，获得经洗涤的细胞混合物；
(S5)
将上述细胞混合物与已经预处理的磁珠混合，获得细胞
‑
磁珠复合物；
(S6)
利用一抗处理上述的细胞
‑
磁珠结合物，获得一抗
‑
细胞
‑
磁珠复合物；
(S7)
利用二抗处理上述一抗
‑
细胞
‑
磁珠复合物，获得二抗
‑
一抗
‑
细胞
‑
磁珠复合物；
(S8)
利用转座酶处理上述二抗
‑
一抗
‑
细胞
‑
磁珠复合物，进行片段化反应，形成
DNA
片段；
(S9)
终止反应并解交联，获得反应终止产物；和
(S10)
分离
、
纯化
、
扩增上述反应终止产物中的
DNA
片段，制备核酸文库
。2.
如权利要求1所述的方法，其特征在于，
(S2)
中，
t1
为5～
60min
；较佳地为
10
～
20min。3.
如权利要求1所述的方法，其特征在于，
(S2)
中，所述通透剂选自下组中的一种或多种：
Tween20、SDS、NP40(
或
IGEPAL CA
‑
630)、Digtonin、CHAPS、
脱氧胆酸钠
...

【专利技术属性】
技术研发人员：李科，时英东，丁帅，周雁红，
申请(专利权)人：苏州近岸蛋白质科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：