一种检测牛痘病毒加帽酶活性的方法技术

本发明专利技术提供了一种体外检测牛痘病毒加帽酶活性的方法。具体地，所述方法包括：A.利用T7 RNA聚合酶转录出目的基因RNA；B.利用3'biotin

【技术实现步骤摘要】
一种检测牛痘病毒加帽酶活性的方法


[0001]本专利技术属于生物工程领域，具体地说，涉及一种检测牛痘病毒加帽酶活性的方法。

技术介绍

[0002]mRNA疫苗技术的飞速发展，导致RNA生物学需求日益增加，而mRNA疫苗制备的关键一步，是mRNA样本的准备。mRNA样本最基本的结构包括5'帽，5'UTR，ORF，3'UTR，3'尾巴。其中，5'帽结构的功能至关重要，首先，它能保护mRNA不被核酸外切酶快速降解；其次，5'帽结构在翻译过程中起着不可或缺的作用，因为真核生物起始因子识别并与mRNA的帽结构结合。此外，5'帽结构在防止先天性免疫传感器识别mRNA方面也起到了进一步的作用。
[0003]目前，有两种不同的方法可以实现体外转录RNA的加帽，一种是共转录加帽：在转录反应过程中添加合成的帽类似物，但该方法的主要限制是体外转录所需的帽类似物和GTP核苷酸之间的竞争，导致部分mRNA未加帽和翻译失活。 该方法优点是操作简便，能够一步实现转录加帽，但缺点是在共转录加帽过程中，有可能引入其他类似帽的类似物，例如“非功能性帽”，ApppN，但仍然能够防止mRNA降解。此外帽结构类似物造价昂贵，不适合大规模生产。
[0004]另一种是酶促反应加帽：转录后加入牛痘病毒加帽酶，产生与最常见的内源性真核帽结构相同的Cap(即m7G帽)。该方法使用酶法加帽，造价低，适用于大规模放大生产。酶法加帽的关键就是牛痘病毒加帽酶，它能将7
‑
甲基鸟苷帽结构(m7Gppp，Cap0)加到RNA的5
´/>末端。在真核生物中，该结构与mRNA的稳定、转运和翻译密切相关。使用酶促反应为RNA加帽是一种简单有效的方法，能显著改善用于体外转录、转染和显微注射的RNA的稳定性和翻译能力。因此，测定牛痘病毒加帽酶的活性具有重要意义。
[0005]目前牛痘病毒加帽酶检测方法主要有放射性底物掺入法、体外翻译、LC
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MS法等。放射性底物掺入法测活法以α
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P标记的GTP为底物，通过牛痘病毒加帽酶将其结合至目标RNA上，通过测定放射性同位素的量测出牛痘病毒加帽酶的活性。该方法安全性低，存在放射性污染，且步骤繁琐，实验环境要求高；体外翻译法通过比较荧光标记基因mRNA在加帽和不加帽情况下细胞转染的蛋白表达量测定牛痘病毒加帽酶的活性。该方法操作简便，但灵敏度低，干扰因素多，测定酶活误差大。LC
‑
MS法通过比较加帽前后产物对的分子量差异进行牛痘病毒加帽酶活性的检测。该方法灵敏度高，精准度高，但是对于仪器有一定要求，成本高。
[0006]因此，本领域仍然需要提供一种能经济、高效地检测牛痘病毒加帽酶活性的方法。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种检测牛痘病毒加帽酶活性的方法。
[0008]在本专利技术的第一方面，提供了一种体外定量检测牛痘病毒加帽酶的活性的方法，包括步骤：(S1) 提供5'末端为5'
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三磷酸的单链RNA分子；
(S2) 在含有3' Biotin GTP的检测反应体系中，使用牛痘病毒加帽酶对所述的单链RNA分子进行加帽反应，获得含加帽产物的第一反应混合物，其中所述加帽产物为含生物素修饰GTP的RNA分子；(S3) 从所述第一反应混合物中分离出所述加帽产物；(S4) 对所述加帽产物进行RT
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PCR，测定的CT值为C1，并将C1与参考CT值C0进行比较，获得CT差值；将所述CT差值与标准值或标准曲线比较，从而获得牛痘病毒加帽酶的活性的定量测定结果。
[0009]在另一优选例中，所述C0为阴性参考体系的CT值，其中，所述阴性参考体系的条件同所述的检测反应体系，但不含有牛痘病毒加帽酶；并且在阴性参考体系中对所述的单链RNA分子进行加帽反应，获得阴性反应混合物，然后对阴性反应混合物进行RT
‑
PCR，测定的CT值记为C0。
[0010]在另一优选例中，所述C0为第一反应混合物参考品的CT值，其中，将第一反应混合物分出一份，记为第一反应混合物参考品；并在步骤(S3)中，从剩余的第一反应混合物分离出所述加帽产物；然后对所述第一反应混合物参考品进行RT
‑
PCR，测定的CT值记为C0。
[0011]在另一优选例中，所述第一反应混合物参考品的体积为第一反应混合物体积的1/50至1/2，较佳地1/20至1/5。
[0012]在另一优选例中，所述CT差值(
△
CT1)=C1
‑
C0。
[0013]在另一优选例中，步骤(S1)中，所述5'末端为5'
‑
三磷酸的单链RNA分子为DNA体外转录获得的mRNA。
[0014]在另一优选例中，步骤(S1)中，所述单链RNA分子的长度为100
‑
2000nt，较佳地为200
‑
1000nt，更佳地500
‑
1000nt。
[0015]在另一优选例中，所述标准值为标准反应体系中测定的CT值或其与C0的差值。
[0016]在另一优选例中，所述标准反应体系含有已知浓度的牛痘病毒加帽酶标准品。
[0017]在另一优选例中，所述的已知浓度包括多个不同浓度或一系列稀释浓度。
[0018]在另一优选例中，所述标准曲线为根据标准反应体系中的牛痘病毒加帽酶而绘制的“酶浓度
‑△
CT”标准曲线。
[0019]在另一优选例中，除了含有已知浓度的牛痘病毒加帽酶标准品之外，所述标准反应体系与(S2)中所述的检测反应体系是相同或基本相同的。
[0020]在另一优选例中，所述标准反应体系和所述(S2)中所述的检测反应体系的反应条件和测量条件是相同的或基本相同的。
[0021]在另一优选例中，步骤(S3)中，所述分离通过链霉亲和素磁珠吸附反应进行。
[0022]在另一优选例中，步骤(S2)中，在加帽反应前的反应体系中，所述RNA的终浓度为1μg/10μl
‑
10μg/10μl，较佳地为5μg/10μl。
[0023]在另一优选例中，步骤(S2)中，在加帽反应前的反应体系中，所述反应体系中包含SAM、10
×
加帽反应缓冲液。
[0024]在另一优选例中，步骤(S2)中，在加帽反应前的反应体系中，所述SAM的终浓度为0.05mM
‑
2mM，较佳地为0.1mM。
[0025]在另一优选例中，步骤(S2)中，在加帽反应前的反应体系中，所述3' Biotin GTP的终浓度为0.1mM
‑
1mM，较佳地为0.2 mM
‑
0.8mM，更佳地为0.5mM。
[0026]在另一优选例中，步骤(S2)中，在加帽反应前的反应体系中，所述牛痘病毒加帽酶的终浓度为0.1U/μl
‑
2U/μl，较佳地为0.5U/μl。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种体外定量检测牛痘病毒加帽酶的活性的方法，其特征在于，包括步骤：(S1) 提供5'末端为5'
‑
三磷酸的单链RNA分子；(S2) 在含有3' Biotin GTP的检测反应体系中，使用牛痘病毒加帽酶对所述的单链RNA分子进行加帽反应，获得含加帽产物的第一反应混合物，其中所述加帽产物为含生物素修饰GTP的RNA分子；(S3) 从所述第一反应混合物中分离出所述加帽产物；(S4) 对所述加帽产物进行RT
‑
PCR，测定的CT值为C1，并将C1与参考CT值C0进行比较，获得CT差值；将所述CT差值与标准值或标准曲线比较，从而获得牛痘病毒加帽酶的活性的定量测定结果；其中，所述C0为阴性参考体系的CT值，其中，所述阴性参考体系的条件同所述的检测反应体系，但不含有牛痘病毒加帽酶；并且在阴性参考体系中对所述的单链RNA分子进行加帽反应，获得阴性反应混合物，然后对阴性反应混合物进行RT
‑
PCR，测定的CT值记为C0；或所述C0为第一反应混合物参考品的CT值，其中，将第一反应混合物分出一份，记为第一反应混合物参考品；并在步骤(S3)中，从剩余的第一反应混合物分离出所述加帽产物；然后对所述第一反应混合物参考品进行RT
‑
PCR，测定的CT值记为C0。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一反应混合物参考品的体积为第一反应混合物体积的1/50至1/2。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一反应混合物参考品的体积为第一反应混合物体积的1/20至1/5。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(S1)中，所述单链RNA分子的长度为100
‑
2000nt。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(S3)中，所述分离通过链霉亲和素磁珠吸附反应进行。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(S3)中，所述分离包括：(1)通过链霉亲和素磁珠吸附第一反应混合物中的生物素修饰GTP的RNA分...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑紫君，李亚丽，汤玉洁，周玥，赵曼曼，张清仪，王明明，朱化星，
申请(专利权)人：苏州近岸蛋白质科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：