DNA纳米球检测探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种DNA纳米球检测探针及其制备方法和应用。所述DNA纳米球检测探针包括单链探针A、单链探针B和单链探针C，所述单链探针A、单链探针B和单链探针C均至少含有一段回文序列的粘性末端，所述每段回文序列为10个碱基，所述单链探针C还具有用于端粒酶反应的引物序列，所述单链探针A、单链探针B和DNA端粒酶产物链D

【技术实现步骤摘要】
DNA纳米球检测探针及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物传感
，更具体地，涉及一种DNA纳米球检测探针及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]端粒是一段具有重复序列(TTAGGG)的DNA序列，通常存在于细胞染色体的末端。在细胞分裂过程中，染色体的复制会导致端粒的不断缩短。而端粒酶作为体内广泛存在的一种逆转录酶，在维持端粒长度以及细胞生长、分化过程中起到非常关键的作用。端粒酶通过在端粒的3'端不断的复制TTAGGG的重复序列达到维持端粒长度以及细胞活性的目的。2009年，ELIZABETN等发现了端粒酶以及端粒对于细胞活性的保护机制而获得了诺贝尔医学奖。此后，许多研究表明端粒酶的活性过高可能会诱导细胞的永久性存活，甚至引发癌症。但是，端粒酶活性过低又会加速细胞衰老，甚至凋亡。在正常人的体细胞中，端粒酶处于抑制的状态，研究发现在包括胃癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌等大多数癌症细胞中，端粒酶的活性明显高于正常水平。因此，端粒酶活性检测在癌症的诊疗等方面具有重大的研究意义。越来越多的研究者发现端粒酶可以作为重要的靶点在癌症的诊断，治疗方面发挥作用。因此，如何准确、灵敏、快速地获得端粒酶活性成为了在临床诊断和治疗方面的一大热点。
[0003]传统的端粒酶检测方法包括端粒重复序列扩增法、端粒重复序列延伸法、荧光素标记的端粒酶重复序列扩增法等，这些方法存在样本需要量大、检测时间长、操作复杂、假阳性、价格昂贵，不能可视判断等缺点。

技术实现思路

[0004]本专利技术为克服上述现有检测方法效果不好的缺陷，提供一种DNA纳米球检测探针。
[0005]本专利技术的另一目的在于提供所述DNA纳米球检测探针的制备方法。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供所述利用DNA纳米球检测探针检测端粒酶活性的方法。
[0007]本专利技术的另一目的在于提供所述DNA纳米球检测探针的应用。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0009]一种DNA纳米球检测探针，其特征在于，包括单链探针A、单链探针B和单链探针C，所述单链探针A、单链探针B和端粒酶引物序列均至少含有一段回文序列的粘性末端，所述单链探针C还具有用于端粒酶反应的引物序列，在端粒酶作用下，单链探针C的末端会延伸出端粒重复序列(TTAGGG)n，得到端粒酶产物链D
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STP；其中，n为大于等于1的整数；所述单链探针A、单链探针 B和DNA端粒酶产物链D
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STP的端粒重复序列部分互补，以形成Y型结构DNA，所述Y型结构DNA以粘性端连接，依次放大排列得到所述DNA纳米球检测探针，所述DNA纳米球检测探针的直径为10～100nm。
[0010]所述回文序列是指核苷酸片段在其中一条链上按5'到3'读取的序列与其互补链上按相同的5'到3'读取的序列一致。
[0011]本专利技术提供了一种DNA纳米球检测探针，所述DNA纳米球检测探针稳定且具有单分散结构，直径在10～100nm。
[0012]优选地，所述单链探针A如序列表中的SEQ ID No.1、2或3所示，所述单链探针B如序列表中的SEQ ID No.4、5或6所示，所述单链探针C的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No.7、8或9所示。
[0013]优选地，所述单链探针A如序列表中的SEQ ID No.1所示、所述单链探针B 如序列表中的SEQ ID No.4所示，所述单链探针C的核苷酸序列如序列表中的 SEQ ID No.7所示。
[0014]优选地，所述DNA纳米球检测探针的直径为80～95nm。
[0015]所述DNA纳米球检测探针在检测端粒酶活性中的应用。
[0016]所述DNA纳米球检测探针在比色传感器中的应用。
[0017]所述DNA纳米球检测探针的制备方法，包括如下步骤：
[0018]S11.将DNA端粒酶产物链D
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STP与单链探针A混合，并在室温下反应20～30 分钟，得到混合液，所述单链探针A的浓度为25～125nM；
[0019]S12.将单链探针B加入到步骤S11中的混合液中室温下反应120～180分钟；所述单链探针B的浓度为25～125nM，得DNA纳米球检测探针。
[0020]优选地，所述DNA端粒酶产物链D
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STP是通过单链探针C在活性端粒酶的作用下，进行延伸反应得到。
[0021]所述活性端粒酶是从HeLa细胞、人肺癌细胞(A549)和人乳腺癌细胞(MCF
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7和MDA
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MB
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231)中提取的。
[0022]所述提取工艺为：收集指数期生长的细胞并计数，将细胞转移到离心管中，在离心机中用磷酸盐缓冲液洗涤两次，离心。立即将细胞重悬于CHAPS裂解缓冲液中，孵育，离心。所得提取物立即用于端粒酶延伸反应。
[0023]所述DNA纳米球检测探针检测端粒酶活性的检测方法，包括如下步骤：
[0024]S21.取权利要求7所制备的DNA纳米球检测探针，加入0.31～0.48μM的 SYBR GreenⅠ反应15～20分钟；
[0025]S22.将4～10nM的金纳米粒子加入到步骤S21中，观察颜色。
[0026]本专利技术首先制备成DNA纳米球，能够为SYBR GreenⅠ(SG)的插入提供了大量的位点，导致溶液中游离的SYBR GreenⅠ极为少量，无法诱导金纳米粒子聚集，使溶液呈红色。在不存在端粒酶的情况下，端粒酶延长的反应不会被激活，因此单链探针A和单链探针B在反应系统中保持完整的单链。SYBR GreenⅠ无法插入到位点中，金纳米粒子通过静电吸引而形成聚集状态，使溶液由红色快速变为蓝色。因此，不需要任何复杂的仪器，就可以用肉眼轻松地通过DNA纳米球检测探针快速的检测端粒酶活性。
[0027]优选地，所述金纳米粒子的平均粒径为11.7～14.2nm。当所述的金纳米粒子的平均粒径为11.7～14.2nm时，效果更好。
[0028]所述金纳米粒子可以通过购买得到，也可以根据文献方法制备得到。
[0029]作为一种实施方式，所述金纳米粒子通过下述方法制备得到：
[0030]将HAuCl4在剧烈搅拌下加热至沸腾，在搅拌下加入柠檬酸三钠，继续沸腾，自然冷却至室温，然后存放在4℃的冰箱中备用。紫外可见吸收光谱通过UV1800 分光光度计进行监测，在520nm处发现一个吸收峰，吸光度为2.7，根据朗伯
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比尔定律计算浓度。
[0031]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0032]本专利技术首先利用回文序列的特有结构，实现普通杂交与回文相互作用的协同作用，在没有任何酶促反应的情况下完成了探针之间的自组装，制备了一种新型的DNA纳米球。另一方面，我们以DNA纳米球为基础，开发了一种新型无标记比色传感方法，可以准确地检测端粒酶在不同细胞系中的活性。所述方法具有灵本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DNA纳米球检测探针，其特征在于，包括单链探针A、单链探针B和单链探针C，所述单链探针A、单链探针B和单链探针C均至少含有一段回文序列的粘性末端，所述单链探针C还具有用于端粒酶反应的引物序列，在端粒酶作用下，单链探针C的末端会延伸出端粒重复序列（TTAGGG）n，得到端粒酶产物链D
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STP；其中，n为大于等于1的整数；所述单链探针A、单链探针B和DNA端粒酶产物链D
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STP的端粒重复序列部分互补，以形成Y型结构DNA，所述Y型结构DNA以粘性端连接，依次放大排列得到所述DNA纳米球检测探针，所述DNA纳米球检测探针的直径为10~100nm。2.根据权利要求1所述DNA纳米球检测探针，其特征在于，所述单链探针A如序列表中的SEQ ID No.1、2或3所示，所述单链探针B如序列表中的SEQ ID No.4、5或6所示，所述单链探针C的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No.7、8或9所示。3.根据权利要求2所述DNA纳米球检测探针，其特征在于，所述单链探针A如序列表中的SEQ ID No.1所示，所述单链探针B如序列表中的SEQ ID No.4所示，所述单链探针C的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No.7所示。4.根据权利要求1所述DNA纳米球检测探针，其特征在于，所述DNA纳米球检测探针的直径为80~95 nm。5....

【专利技术属性】
技术研发人员：何婧琳，唐玲，梅婷婷，廖诗晴，郭美彤，
申请(专利权)人：长沙理工大学，
类型：发明
国别省市：