PolyA聚合酶活性检测方法技术

本发明专利技术公开了PolyA聚合酶活性检测方法，通过人工合成一条miRNA序列，使用PAP酶进行加尾反应，之后用逆转录酶进行逆转录，所用逆转录引物为荧光标记的Oligo(dT)，Oligo(dT)能够与足够长的poly(A)在任意位置结合，进行充分逆转录反应后，所得cDNA长度能够如实地反应PAP酶的加尾活性和规律，用RNaseH消化miRNA并进行毛细管电泳。本发明专利技术使用Oligo(dT)和逆转录酶进行反应，进行逆转录后以含有荧光标记的cDNA作为检测物，结果更稳定。本方法能够充分、直观地反映PolyA聚合酶加尾规律，而非整体数值总和，能够细节性地展示PolyA聚合酶的催化效果。效果。

【技术实现步骤摘要】
PolyA聚合酶活性检测方法


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，具体地说，涉及PolyA聚合酶活性检测方法。

技术介绍

[0002]PolyA聚合酶(Poly(A)polymerase，缩写PAP)是一种可以对单链RNA 3
’‑
OH末端加尾的聚合酶，在Mg
2+
和ATP存在的情况下，其能够通过以不依赖模板的方式，对单链RNA的3
’‑
OH末端偏好性地添加三磷酸腺苷(rATP)，可以对RNA加至少20个A(即加尾活性)。PAP被广泛应用于分子生物学研究和生物医药领域，如二代测序中对miRNA加poly(A)尾巴，以利于下游对miRNA进行扩增富集；或在一些RNA疫苗制备过程中，会使用PAP添加poly(A)尾巴，以减少下游操纵中RNA疫苗的降解。
[0003]对于分子生物学研究和生物医药领域而言，PAP的活性是影响后续实验结果或试剂稳定性和可靠性的关键因素之一，因此检测和保证PAP的活性水平十分重要。
[0004]目前PAP活性检测方法主要有：(1)放射性同位素的方法本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.PolyA聚合酶活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用待测PolyA聚合酶对RNA模板进行加尾反应；(2)加尾反应结束后，使用逆转录引物进行逆转录反应；(3)获取所述逆转录反应得到的cDNA的长度；(4)将cDNA长度数据带入基于PolyA聚合酶标准品建立的PolyA聚合酶标准曲线中，得到所述待测PolyA聚合酶的酶活性。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA模板3
’
端不含有碱基A，且长度大于等于15nt；优选地，所述RNA模板内部不含有15个以上的碱基A，且不含有GC组成的回文或重复序列；更优选地，所述RNA模板的长度为20～25nt。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述逆转录引物为5
’
端带荧光标记的Oligo(dT)
n
，n与所述RNA模板的碱基个数相同。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述荧光标记选自FAM、Cy3、HEX或TAMARA。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)获取所述逆转录反应得到的cDNA的长度具体包括：将所述逆转录反应的产物进行毛细管电泳，然后利用如下式I、式II或最长加尾长度参数确定cDNA的长度：L＝P
Test
‑
P
CK
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
式I其中，L为加尾长度，P
Test
为各实验组cDNA主要出峰位置，P
CK
为阴性对照；L
’
＝P
Max
‑
P
CKmax
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
式I...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖晓文，王文朋，
申请(专利权)人：北京梓熙生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：