PolyA聚合酶活性检测方法技术

本发明专利技术公开了PolyA聚合酶活性检测方法，通过人工合成一条miRNA序列，使用PAP酶进行加尾反应，之后用逆转录酶进行逆转录，所用逆转录引物为荧光标记的Oligo(dT)，Oligo(dT)能够与足够长的poly(A)在任意位置结合，进行充分逆转录反应后，所得cDNA长度能够如实地反应PAP酶的加尾活性和规律，用RNaseH消化miRNA并进行毛细管电泳。本发明专利技术使用Oligo(dT)和逆转录酶进行反应，进行逆转录后以含有荧光标记的cDNA作为检测物，结果更稳定。本方法能够充分、直观地反映PolyA聚合酶加尾规律，而非整体数值总和，能够细节性地展示PolyA聚合酶的催化效果。效果。

【技术实现步骤摘要】
PolyA聚合酶活性检测方法


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，具体地说，涉及PolyA聚合酶活性检测方法。

技术介绍

[0002]PolyA聚合酶(Poly(A)polymerase，缩写PAP)是一种可以对单链RNA 3
’‑
OH末端加尾的聚合酶，在Mg
2+
和ATP存在的情况下，其能够通过以不依赖模板的方式，对单链RNA的3
’‑
OH末端偏好性地添加三磷酸腺苷(rATP)，可以对RNA加至少20个A(即加尾活性)。PAP被广泛应用于分子生物学研究和生物医药领域，如二代测序中对miRNA加poly(A)尾巴，以利于下游对miRNA进行扩增富集；或在一些RNA疫苗制备过程中，会使用PAP添加poly(A)尾巴，以减少下游操纵中RNA疫苗的降解。
[0003]对于分子生物学研究和生物医药领域而言，PAP的活性是影响后续实验结果或试剂稳定性和可靠性的关键因素之一，因此检测和保证PAP的活性水平十分重要。
[0004]目前PAP活性检测方法主要有：(1)放射性同位素的方法，在活性反应过程中使用同位素3
H
标记的rATP，通过检测产物的放射性强度，反映PAP的poly(A)加尾活性；(2)单链RNA毛细管电泳法，使用Cy5、FAM或其它荧光素标记的单链RNA直接进行PAP活性反应，然后使用毛细管电泳的方法检测单链RNA长度变化，最终确定PAP所加poly(A)尾巴长度，以此确定PAP活性。但上述方法分别存在以下问题：(1)放射性同位素对人体和环境有毒害作用，操作过程十分繁琐；(2)单链RNA毛细管电泳法直接使用荧光标记的单链RNA，但在操作过程中，由于RNA极易降解，因而会导致结果不稳定。因此亟需开发一种方便快捷、安全可靠的PolyA聚合酶活性检测方法。PolyA聚合酶活性检测方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种新型的PolyA聚合酶活性检测方法。
[0006]为了实现本专利技术目的，本专利技术提供一种PolyA聚合酶活性检测方法，包括以下步骤：
[0007](1)利用待测PolyA聚合酶对RNA模板进行加尾反应；
[0008](2)加尾反应结束后，使用逆转录引物进行逆转录反应；
[0009](3)获取所述逆转录反应得到的cDNA的长度；
[0010](4)将cDNA长度数据带入基于PolyA聚合酶标准品建立的PolyA聚合酶(酶活
‑
cDNA长度)标准曲线中，得到所述待测PolyA聚合酶的酶活性。
[0011]前述的方法，所述RNA模板3
’
端不含有碱基A，且长度大于等于15nt。
[0012]优选地，所述RNA模板内部不含有15个以上的碱基A，且不含有GC组成的回文或重复序列。
[0013]更优选地，所述RNA模板的长度为20～25nt。
[0014]前述的方法，所述逆转录引物为5
’
端带荧光标记的Oligo(dT)
n
，n与所述RNA模板的碱基个数相同。
[0015]优选地，所述荧光标记选自FAM、Cy3、HEX或TAMARA等，优选FAM。
[0016]例如，所述RNA模板为5
’‑
ccucacugcucucucugucagc
‑3’
，所述5
’
端带荧光标记的Oligo(dT)
n
中n＝22。
[0017]所述PolyA聚合酶标准品可以是商品化PAP，如NEB公司的PAP酶或北京全式金生物技术有限公司的PAP酶。
[0018]所述待测PolyA聚合酶包括但不限于由工程菌表达的PolyA聚合酶。
[0019]前述的方法，步骤(4)获取所述逆转录反应得到的cDNA的长度具体包括：将所述逆转录反应的产物进行毛细管电泳，然后利用如下式I、式II或最长加尾长度参数确定cDNA的长度：
[0020]L＝P
Test
‑
P
CK
ꢀꢀꢀ
式I
[0021]其中，L为加尾长度，P
Test
为各实验组cDNA主要出峰位置，P
CK
为阴性对照；
[0022]L
’
＝P
Max
‑
P
CKmax
ꢀꢀꢀ
式II
[0023]其中，L
’
为加尾长度，P
Max
为峰最高强度对应的出峰位置，P
CKmax
为阴性对照峰最高强度对应的出峰位置；
[0024]所述最长加尾长度参数是指在毛细管电泳的检测极限内，测得的最长加尾长度。
[0025]前述的方法，步骤(4)中标准曲线的建立方法包括：
[0026]1)将PolyA聚合酶标准品进行梯度稀释，获得梯度酶活性的PolyA聚合酶标准品；
[0027]2)利用梯度酶活性的PolyA聚合酶标准品分别对RNA模板进行加尾反应；
[0028]3)加尾反应结束后，使用逆转录引物进行逆转录反应；
[0029]4)获取所述逆转录反应得到的cDNA的长度；
[0030]5)根据cDNA长度数据与PolyA聚合酶酶活性的对应关系建立标准曲线。
[0031]前述的方法，所述逆转录反应结束后，还包括降解RNA模板的步骤。
[0032]优选地，采用核糖核酸酶H降解RNA模板。
[0033]前述的方法，降解RNA模板后，还包括失活酶(核糖核酸酶H)的步骤。
[0034]本专利技术还提供一种检测PolyA聚合酶活性的试剂盒，包括RNA模板和逆转录引物。
[0035]所述RNA模板3
’
端不含有碱基A，且长度大于等于15nt；优选地，所述RNA模板内部不含有15个以上的碱基A，且不含有GC组成的回文或重复序列；更优选地，所述RNA模板的长度为20～25nt。
[0036]所述逆转录引物为5
’
端带荧光标记的Oligo(dT)
n
，n与所述RNA模板的碱基个数相同。
[0037]进一步地，所述试剂盒还包括PolyA聚合酶标准品。
[0038]优选地，所述试剂盒还包括加尾反应试剂、逆转录反应试剂和/或核糖核酸酶H。
[0039]进一步地，加尾反应的条件为：37℃反应5～60min。
[0040]进一步地，使PolyA聚合酶失活的条件为：65℃处理5min。
[0041]进一步地，逆转录反应的条件为：37℃～55℃(优选42℃)反应30～120min。
[0042]进一步地，降解RNA链的条件为：37℃处理2min。
[0043]进一步地，使酶失活的条件为：85℃处理5min。
[0044]在本专利技术的一个具体实施方式中，PolyA聚合酶活性检测方法包本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.PolyA聚合酶活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用待测PolyA聚合酶对RNA模板进行加尾反应；(2)加尾反应结束后，使用逆转录引物进行逆转录反应；(3)获取所述逆转录反应得到的cDNA的长度；(4)将cDNA长度数据带入基于PolyA聚合酶标准品建立的PolyA聚合酶标准曲线中，得到所述待测PolyA聚合酶的酶活性。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA模板3
’
端不含有碱基A，且长度大于等于15nt；优选地，所述RNA模板内部不含有15个以上的碱基A，且不含有GC组成的回文或重复序列；更优选地，所述RNA模板的长度为20～25nt。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述逆转录引物为5
’
端带荧光标记的Oligo(dT)
n
，n与所述RNA模板的碱基个数相同。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述荧光标记选自FAM、Cy3、HEX或TAMARA。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)获取所述逆转录反应得到的cDNA的长度具体包括：将所述逆转录反应的产物进行毛细管电泳，然后利用如下式I、式II或最长加尾长度参数确定cDNA的长度：L＝P
Test
‑
P
CK
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
式I其中，L为加尾长度，P
Test
为各实验组cDNA主要出峰位置，P
CK
为阴性对照；L
’
＝P
Max
‑
P
CKmax
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
式I...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖晓文，王文朋，
申请(专利权)人：北京梓熙生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：