一种嵌合酶及其在体外一步反应合成Cap0mRNA的用途和方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，特别是一种嵌合酶及其在体外转录中一步合成Cap0mRNA的用途和方法，所述方法包括利用嵌合酶和体外转录模板混合后共反应，一步反应获得加帽加尾的mRNA产物，所述嵌合酶包括RNA聚合酶结构域和加帽酶催化结构域，所述嵌合酶经嵌合设计具备体外转录和加帽的双重功能。本发明专利技术开辟了体外酶法一步合成mRNA的方法，提高了合成效率和mRNA产率。mRNA产率。

【技术实现步骤摘要】
一种嵌合酶及其在体外一步反应合成Cap0 mRNA的用途和方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，特别是涉及一种嵌合酶及其在体外一步反应合成Cap0 mRNA的用途和方法。

技术介绍

[0002]近年来，以呼吸道为主的传染病严重威胁公众健康，在此背景下，基于mRNA的体外转录技术由于在研发设计中仅需提供抗原的基因序列，而不必进行高致病性病原的分离培养，在应对高传播风险的病毒时优势明显，且mRNA疫苗生产工艺简单、合成快速、成本较低，提供天然抗原表位，所以成为一种极具优势的新型疫苗。
[0003]mRNA的体外转录体系的工作原理是以DNA为模板，在一系列转录因子的作用下，经过RNA聚合酶合成RNA。转录反应中合成的加帽RNA可以用于体外翻译、转染等试验。常用的聚合酶为噬菌体来源的RNA聚合酶，如T7、SP6、T3等，其中T7 RNA聚合酶(T7 RNA Polymerase)是一种高度特异识别T7启动子序列的DNA依赖的5'
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3'RNA聚合酶。T7 RNA聚合酶可以催化单链或双链DNA T7启动子下游NTP的掺入，合成与T7启动子下游的模板DNA互补的RNA。由于转录得到的RNA是不稳定的，因此需要对RNA进行加工修饰，包括5
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端形成帽子结构，3
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端添加poly(A)尾巴结构，起到稳定RNA、防止降解、帮助翻译等作用。体外mRNA加帽有两种常用方法，第一种是在mRNA转录系统中添加一个规则的m7GpppG帽类似物结构或者抗反向帽类似物(ARCA)来实现mRNA加帽及体外转录。第二种是在体外转录初期，通过加帽酶反应完成mRNA加帽，牛痘病毒加帽酶是催化形成帽子结构的有效酶，其由D1和D12两个亚基组成，兼具RNA三磷酸酯酶活性、鸟苷酰基转移酶活性和鸟嘌呤甲基转移酶活性，可将7
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甲基鸟嘌呤帽结构(m7Gppp)连接到RNA的5'末端(m7Gppp5'N)。
[0004]目前，市场上的体外转录试剂盒主要是针对以上两种方法开发的，第一种依靠帽类似物在转录过程中产生帽子结构的方法，效率不高，产率较低，产生的转录产物的免疫原性较高，对后续转录产物mRNA的应用造成困难。第二种利用加帽酶对RNA的5
’
端添加帽子结构，此类产品也是在获得体外转录的RNA基础上，对产物进行加帽，这样的方法从转录、加帽到加尾涉及多次加酶操作，耗时较长，程序繁琐，流转的过程也会造成中间产物的降解和损失，整体的效率和产率都有待提升。
[0005]针对上述市场产品存在的技术问题，尤其是针对转录加帽如何同步工作，同时能够产生高质量转录产物的问题，许多专业人员都进行了相关改造和探索，比如在利用原核系统中的相关转录工具酶制备mRNA，选择将原核细胞裂解以后获得其中的RNA聚合酶和加帽酶，但是该法的裂解产物为原核细胞中的所有酶类，其中不乏大肠内源其他杂质核酸酶或核酸，这样会导致酶系统的特异性不高，降低后续的mRNA的生成效率、质量和产量。甚至会直接将RNA降解，无法有效转录目的片段。
[0006]所以目前缺乏工艺简便、流程较短的规模化量产的mRNA生产技术，建立这样一套操作简便、稳定性好、高效的mRNA制备方法将推动mRNA疫苗平台，助力未来的疫苗研发进
程。

技术实现思路

[0007]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种嵌合酶及体外一步反应合成Cap0 mRNA的方法，用于解决现有技术中的问题。
[0008]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种用于体外酶法一步合成mRNA的嵌合酶，所述嵌合酶为转录加帽嵌合酶，其特征在于，所述嵌合酶包含加帽酶结构域和RNA聚合酶结构域，所述RNA聚合酶结构域包括RNA聚合酶和Spy Catcher，所述加帽酶催化结构域包括病毒加帽酶和Spy Tag；或，所述RNA聚合酶结构域包括RNA聚合酶和Spy Tag，所述加帽酶催化结构域包括病毒加帽酶和Spy Catcher；所述嵌合酶中Spy Tag和Spy Catcher共价结合；所述RNA聚合酶结构域和加帽酶催化结构域中均还包括蛋白纯化标签。
[0009]本专利技术还提供一种体外转录一步合成mRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
①
获得mRNA转录的模板DNA；
②
加入所述嵌合酶进行体外转录一步获得具有Cap0帽子结构的mRNA。
[0010]本专利技术还提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码所述RNA聚合酶结构域和/或加帽酶催化结构域。
[0011]本专利技术还提供一种核酸构建体，所述包括所述多核苷酸。
[0012]本专利技术还提供一种细胞，所述细胞中包括所述的核酸构建体或基因组中整合有外源的所述的多核苷酸。
[0013]本专利技术还提供所述嵌合酶的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
[0014]1)将包括所述RNA聚合酶结构域的构建体和包括加帽酶催化结构域的构建体共转染至宿主细胞中，培养所述宿主细胞；
[0015]2)从培养体系中提取得到嵌合酶。
[0016]本专利技术还提供一种用于体外一步合成具有5
’
端帽结构的mRNA的试剂盒，所述试剂盒包括所述的嵌合酶。
[0017]本专利技术还提供所述嵌合酶、所述多核苷酸、所述核酸构建体、所述试剂盒在体外合成具有5
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端帽结构的mRNA的用途。
[0018]如上所述，本专利技术的体外一步合成具有5
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端帽结构的mRNA的方法，具有以下有益效果：本专利技术将T7RNA聚合酶和加帽酶嵌合，可以在体外转录的过程中同时完成加帽工作，牛痘病毒加帽酶能够在一小时之内对mRNA进行加帽，效率达到近100％，并且方向正确。将T7RNA聚合酶和加帽酶基于连接肽嵌合并以原核生物作为生产平台生成嵌合酶，该嵌合酶能够在蛋白质翻译过程中一步完成RNA的转录和5
’
端的加帽工作。通过协同工作，简化了RNA的转录后修饰，提高了蛋白表达的效率。本专利技术所述嵌合酶简化了传统mRNA合成按步、分次的过程，缩短了整体的合成时间，提高了反应效率，减少了中间产物在分步反应过程中的损耗，提高了mRNA得率，同时在具有相应原件的表达载体上，能够获得稳定的mRNA。节约了mRNA的生产工艺和成本，能够适应工业化生产需求，为mRNA的经济高效生产奠定基础。
附图说明
[0019]图1显示为T7 RNA聚合酶和牛痘病毒加帽酶嵌合酶SDS
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PAGE电泳图，MK:180KD蛋
白Marker，R:SDS
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PAGE还原电泳；
[0020]图2显示为嵌合酶与分步转录和加帽的mRNA产物产出对比图；其中1和2分别为嵌合酶与分步转录和加帽的mRNA核酸检测电泳图。
[0021]图3显示为荧光显微镜下观察体外转录EGFP mRNA表达验证，A为阴性对照，B为分步法的荧光信号，C为嵌合酶的荧光信号。
[0022]图4显本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于体外酶法一步合成mRNA的嵌合酶，所述嵌合酶为转录加帽嵌合酶，其特征在于，所述嵌合酶包含加帽酶结构域和RNA聚合酶结构域，所述RNA聚合酶结构域包括RNA聚合酶和Spy Catcher，所述加帽酶催化结构域包括病毒加帽酶和Spy Tag；或，所述RNA聚合酶结构域包括RNA聚合酶和Spy Tag，所述加帽酶催化结构域包括病毒加帽酶和Spy Catcher；所述嵌合酶中Spy Tag和Spy Catcher共价结合；所述RNA聚合酶结构域和加帽酶催化结构域中均还包括蛋白纯化标签。2.权利要求1所述的嵌合酶在体外转录中一步合成mRNA的应用。3.一种体外转录一步合成mRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
①
获得mRNA转录的模板DNA；
②
加入权利要求1所述的嵌合酶共反应进行体外转录一步获得具有Cap0帽子结构的mRNA。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：1)所述模板DNA选自质粒DNA或分离的目的DNA片段；2)所述方法还包括将缓冲液加入到嵌合酶与模板DNA的共反应体系中；3)所述方法还包括将dNTP加入到嵌合酶与模板DNA的共反应体系中；4)所述方法还包括将甲基化供体试剂加入到嵌合酶与模板DNA的共反应体系中；5)共反应条件为35℃～38℃反应2
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3小时；6)所述方法还包括将共反应获得的具有Cap0帽子结构的mRNA进行纯化。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述质粒DNA中包括目的DNA和载体，所述载体中包括T7启动子、5'和3'UTR以及PolyA尾元件。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述质粒DNA为可线性化的质粒DNA，所述可线性化的质粒DNA的载体的序列如SEQ ID NO:13所示。7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述嵌合酶中RNA聚合酶为噬菌体来源的RNA聚合酶、原核生物的RNA聚合酶、真核生物的RNA聚合酶或在线粒体及叶绿体中的RNA聚合酶；和/或，所述嵌合酶中病毒加帽酶选自以下中的一种或...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔利兰，王凡，邹媛华，徐志豪，张静华，郑紫君，王明明，
申请(专利权)人：苏州近岸蛋白质科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：