用于制备鼠胆管类器官的组合物及鼠胆管类器官的制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及医药领域，特别是涉及用于制备鼠胆管类器官的组合物及鼠胆管类器官的制备方法和用途，所述组合物包括组织消化试剂，所述组织消化试剂中包括胶原酶IV和中性蛋白酶。所述组合物还包括培养基，以培养基的总体积为基准，所述培养基包括以下成分：基础培养基、L

【技术实现步骤摘要】
用于制备鼠胆管类器官的组合物及鼠胆管类器官的制备方法和用途


[0001]本专利技术涉及医药领域，特别是涉及用于制备鼠胆管类器官的组合物及鼠胆管类器官的制备方法和用途。

技术介绍

[0002]人体胆道系统的结构像树一样：一部分位于肝脏内部，即肝内胆管，常简称为肝胆管，类似于树的枝叉，有各级分支，被称为一级胆管、二级胆管、三级胆管等等；另一部分在肝脏外部，即肝外胆管，类似于树干，包括肝总管、胆囊和胆囊管、胆总管。小鼠和离体人源肝脏模型显示，肝胆管具有再生潜能。由于肝脏细胞在解离过程中易破裂，因此直接制备肝脏类器官培养成功率较低。此外，肝胆管细胞可转化生成肝实质细胞；因此胆管类器官有望作为肝实质细胞来源候选库，应用于肝实质细胞疗法，缓解临床肝脏移植供体短缺的压力。但目前鼠胆管类器官培养的报道较少，更无实现高密度培养的方法。

技术实现思路

[0003]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供用于制备鼠胆管类器官的组合物及鼠胆管类器官的制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。
[0004]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种用于制备鼠胆管类器官的组合物，所述组合物包括组织消化试剂，所述组织消化试剂中包括胶原酶IV和中性蛋白酶。
[0005]优选的，所述组合物还包括培养基，以培养基的总体积为基准，所述培养基包括以下成分：基础培养基L
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谷氨酰胺或其替代品
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1.5~2.5 mMHEPES
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8~12 mMB27
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1.5~2.5 %乙酰半胱氨酸
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0.5~1.5 mMRSPO
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100 ~300 ng/mL烟酰胺
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8~12 mM胃泌素 I 肽
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8~12 nM上皮生长因子
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30~150 ng/mL成纤维细胞生长因子10
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50~200 ng/mL肝细胞生长因子
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30 ~150 ng/mL。
[0006]本专利技术还提供所述的组合物在制备鼠胆管细胞分离产品或制备鼠胆管类器官中的用途。
[0007]本专利技术还提供一种鼠胆管类器官的制备方法，所述方法包括如下步骤：1）将鼠肝脏组织块与清洗液混合，静置待组织块沉降后，弃上清；
2）将步骤1）获得的产物与所述组合物中的组织消化试剂混合，消化20~30min，终止消化后静置以使胆管组织沉淀，去除消化液，重悬细胞；3）将细胞与基质胶混合并接种至培养容器中，待基质胶凝固后，加入所述组合物中的培养基进行培养，培养3~5天即获得鼠胆管类器官。
[0008]本专利技术还提供所述的制备方法获得的鼠胆管类器官。
[0009]本专利技术还提供所述的鼠胆管类器官在制备肝实质细胞产品或胆道修复产品或胆道再生产品或肝脏移植产品中的用途。
[0010]如上所述，本专利技术的用于制备鼠胆管类器官的组合物及鼠胆管类器官的制备方法和用途，具有以下有益效果：对健康胆管细胞的损伤小，可以提高胆管细胞消化后的细胞活力，而且不需要红细胞裂解液裂解红细胞，能够获得活力高的单细胞和细胞团，因此方法较简单，可以实现胆管类器官的高密度培养，为开辟类器官应用于临床上进行器官修复、促成胆管系统再生提供了试验的原型。器官修复过程中，自体组织是很紧缺的，因此在供体组织较少的情况下，本专利技术能够进行高密度培养，就可以实现取材少而得率高的效果
附图说明
[0011]图1显示为本专利技术的提取的小鼠胆管细胞或细胞团。
[0012]图2显示为本专利技术培养5天的小鼠胆管类器官图。
[0013]图3显示为培养3天的胆管类器官图。
[0014]图4显示为上皮细胞标志物图。
[0015]图5显示为胆管标志物图。
[0016]图6显示为胆管类器官标志物融合图。
具体实施方式
[0017]本专利技术提供一种用于制备鼠胆管类器官的组合物，所述组合物包括组织消化试剂，所述组织消化试剂中包括胶原酶IV和中性蛋白酶。
[0018]在本专利技术的某些实施方式中，所述组织消化试剂为液体或固体。在本专利技术的某些实施方式中，所述组织消化试剂为液体。
[0019]以液体组织消化试剂的总体积为基准，所述胶原酶IV的终浓度为0.05~0.2U/mL。所述胶原酶IV的终浓度例如选自以下任一范围：0.05~0.1U/mL、0.1~0.15U/mL、0.15~0.2U/mL。优选的，所述胶原酶IV的终浓度为0.05~0.15U/mL。更优选的，胶原酶IV的终浓度为0.1U/mL。
[0020]以液体组织消化试剂的总体积为基准，所述中性蛋白酶的终浓度为0.5~1.5U/mL。所述中性蛋白酶的终浓度例如选自以下任一范围：0.5~0.7U/mL、0.7~0.9U/mL、0.9~1.1U/mL、1.1~1.3U/mL、1.3~1.5U/mL。优选的，所述中性蛋白酶的终浓度为0.6~1.0U/mL。更优选的，中性蛋白酶的终浓度为0.8U/mL。
[0021]中性蛋白酶是最早用于工业生产的蛋白酶。大多数微生物产生的中性蛋白酶是金属酶，一分子酶蛋白中含一原子锌，分子质量为35，000
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40，000，等电点pI为8～9，是微生物蛋白酶中最不稳定的酶，很易自溶，即使在低温冰冻干燥，也会造成分子质量的明显减少。所述中性蛋白酶选自耐热解蛋白芽孢杆菌所产生的热解素或枯草杆菌产生的中性蛋白酶。
优选的，所述中性蛋白酶选自Dispase II。
[0022]所述组织消化试剂用于消化动物组织。所述组织消化试剂用来分散组织，以达到离散细胞，获得细胞悬液的目的。所述组织消化试剂用于消化肝组织、神经元、睾丸组织。在一优选的实施方式中，适用于消化鼠源肝组织。所述鼠源肝组织来源于大鼠或小鼠。
[0023]所述组合物还包括培养基，以培养基的总体积为基准，所述培养基包括以下成分：基础培养基L
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谷氨酰胺或其替代品
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1.5~2.5 mMHEPES
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1.5~2.5 %乙酰半胱氨酸
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0.5~1.5 mMRSPO
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100 ~300 ng/mL烟酰胺
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8~12 mM胃泌素 I 肽
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8~12 n本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于制备鼠胆管类器官的组合物，其特征在于，所述组合物包括组织消化试剂和培养基，所述组织消化试剂由胶原酶IV和中性蛋白酶组成，以组织消化试剂的总体积为基准，所述胶原酶IV的终浓度为0.05~0.2U/mL，所述中性蛋白酶的终浓度为0.5~1.5U/mL；以培养基的总体积为基准，所述培养基包括以下成分：基础培养基L
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谷氨酰胺或其替代品
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1.5~2.5 mMHEPES
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1.5~2.5 %乙酰半胱氨酸
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0.5~1.5 mMRSPO
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100 ~300 ng/mL烟酰胺
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8~12 mM胃泌素 I 肽
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8~12 nM上皮生长因子
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30~150 ng/mL成纤维细胞生长因子10
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50~200 ng/mL肝细胞生长因子
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30 ~150 ng/mL。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组织消化试剂为用于消化肝组织的消化试剂。3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组织消化试剂为用于消化鼠源肝组织的消化试剂，和/或，所述基础培养基选自DMEM/F12或Advanced DMEM/F12。4.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李景辉，郑璐，朱化星，王英明，
申请(专利权)人：苏州近岸蛋白质科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：