一种从人脐带静脉获得人静脉内皮细胞的方法技术

本发明专利技术涉及细胞分离和扩增技术领域，提供了一种从人脐带静脉获得人静脉内皮细胞的方法，包括如下步骤：(1)将脐带剪成3～5cm的脐带段，冲洗后，备用；(2)剪开所述脐带段后暴露脐静脉，去除周边组织并清洗至无血液后备用；(3)用镊子提取步骤(2)处理后的脐静脉开口一侧，灌注I型胶原酶进行消化；(4)用完全培养基冲洗步骤(3)消化后的脐静脉，收集冲洗液；(5)将所述冲洗液离心，收集细胞沉淀，用完全培养基重悬所述细胞沉淀，得到细胞悬液；(6)将所述细胞悬液进行培养，传代，得到纯化的人静脉内皮细胞。本发明专利技术通过免疫荧光细胞化学染色法鉴定内皮细胞标志物的表达，为心血管疾病的发病机制研究奠定基础。研究奠定基础。研究奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种从人脐带静脉获得人静脉内皮细胞的方法


[0001]本专利技术涉及细胞分离和扩增
，尤其涉及一种从人脐带静脉获得人静脉内皮细胞的方法。

技术介绍

[0002]血管内皮细胞是位于血管内壁的一种具有多种生理功能的单层细胞，可产生和分泌多种生物活性物质，在血管的生物构建、血压调节、抗凝血、维持机体内外环境的平衡等方面具有重要作用。血管内皮细胞受损、功能紊乱是高血压、动脉粥样硬化以及冠心病等多种心血管疾病的始动环节，同时血管内皮功能障碍也是心血管疾病危险因子作用的靶器官，因此保护血管内皮功能成为治疗心血管疾病的新靶点之一。内皮细胞的体外培养是研究内皮细胞功能的重要手段，然而由于种属差异，仅从动物血管中分离内皮细胞远不能满足日益增长的临床转化研究需求。新生儿脐带取材方便，来源充足，是伦理条件下极少数可以从健康人体获得的健康器官/组织，脐静脉随即成为血管内皮细胞体外实验的主要材料。有关人脐静脉内皮细胞(human umbilicalveinendothelialcells，HUVEC)分离培养已有报道，传统方法通常需要助手搭档，分离方法因步骤较为繁琐而导致细胞产量低和易污染。
[0003]因此，急需建立一套步骤简单，便于独立操作、易复制、试剂耗材极简的高效稳定分离培养HUVEC的方法，为心血管疾病的发病机制研究奠定基础。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种从人脐带静脉获得人静脉内皮细胞的方法，免去结扎脐带的步骤，大大降低了因多操作步骤带来的污染。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种从人脐带静脉获得人静脉内皮细胞的方法，包括如下步骤：
[0007](1)将脐带剪成3～5cm的脐带段，冲洗后，备用；
[0008](2)剪开所述脐带段后暴露脐静脉，去除周边组织并清洗至无血液后备用；
[0009](3)用镊子提取步骤(2)处理后的脐静脉开口一侧，灌注I型胶原酶进行消化；
[0010](4)用完全培养基冲洗步骤(3)消化后的脐静脉，收集冲洗液；
[0011](5)将所述冲洗液离心，收集细胞沉淀，用完全培养基重悬所述细胞沉淀，得到细胞悬液；
[0012](6)将所述细胞悬液进行培养，传代，得到纯化的人静脉内皮细胞。
[0013]优选的，所述冲洗是用试剂为含有1.0％(v/v)PS的PBS。
[0014]优选的，步骤(3)所述的I型胶原酶的浓度为1.0mg/ml，所述I型胶原酶的用量为灌注至I型胶原酶从脐静脉另一端流出为止。
[0015]优选的，步骤(3)所述消化的温度为37℃；所述消化的时间约为20min。
[0016]优选的，步骤(4)所述每根脐静脉冲洗使用完全培养基冲洗2
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3次；所述完全培养基冲洗一次的用量为2mL。
[0017]优选的，步骤(5)所述离心的时间为5min；所述离心的转速为1000rpm。
[0018]优选的，步骤(5)所述重悬加入完全培养基的量为6
‑
10cm脐带消化所得的细胞加入4ml完全培养基重悬。
[0019]优选的，步骤(6)所述培养的温度为37℃；CO2的浓度为5％，培养5～7h后换液一次，培养22～26h后换液一次，继续培养3～4d。
[0020]优选的，步骤(6)所述传代是待细胞融合度达85～95％时，用体积分数为0.25％胰酶按1：4消化传代，传代1～2次，得到人静脉内皮细胞。
[0021]本专利技术与传统的内部灌注消化酶后结扎脐带两端的思路不同，传统结扎脐带的方法，单人操作不便，涉及的器械较多，增加了污染的机会。本专利技术最大的特点在于摆脱了脐带要结扎的思维定式，不结扎脐带而是撕开脐带外层的华通胶，让脐静脉暴露。且本专利技术在操作中只需两把有齿镊，沿脐静脉外的华通胶撕开脐带暴露部分脐静脉，一方面保障血管的生理活性，一方面因血管自身软塌的特点，可将注入的酶适度保存在血管中，且在可视状态下完成，可自行适量保留在血管中，保证无气泡，无须再结扎血管两端，避免因脐带过长注入I型胶原酶困难的问题大大降低了因多操作步骤带来的污染。
[0022]本专利技术旨在建立一套步骤简单，便于独立操作、易复制、试剂耗材极简的高效稳定分离培养HUVEC的方法，通过免疫荧光细胞化学染色法鉴定内皮细胞标志物的表达，为心血管疾病的发病机制研究奠定基础。
附图说明
[0023]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0024]图1为实施例1中暴露脐静脉冲洗并注入消化酶操作图；
[0025]图2为实施例1中原代人脐静脉内皮细胞生长速度(A：分离后6小时；B：分离后24小时；C：分离后4天)；
[0026]图3为实施例1中对第二代人脐静脉内皮细胞进行CD31免疫荧光染色。
具体实施方式
[0027]下面结合实施例对本专利技术提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。
[0028]实施例1
[0029]一、材料
[0030]1.20cm
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10cm托盘2个
[0031]2.有齿镊(2把，大号)
[0032]3.组织剪(1把)
[0033]4.1mg/ml的I型胶原酶5ml(WorshingtonCAT#:LS004194，用ECM培养基配制，方便观察I型胶原酶注入血管)
[0034]5.体积分数1.0％的盘尼西林
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链霉素溶液(PS)100ml(PBS配置)
[0035]6.完全ECM培养基10ml(ScienceCellECM)
[0036]7.ECM培养基5ml(ScienceCellECM)
[0037]8.直径10cm培养皿4个(大皿)
[0038]9.直径为6cm培养皿1个(中皿)
[0039]10.15ml离心管1只
[0040]11.0.1％(体积分数)明胶2ml
[0041]12.高温灭菌袋1个
[0042]13.恒温箱
[0043]二、步骤
[0044]对托盘、有齿镊及组织剪装于灭菌袋中在121℃、103kPa下灭菌20min。将恒温箱温度调至37℃。将0.1％明胶铺于直径为6cm的中皿2h。
[0045]在直径10cm的大皿中装20ml含有体积分数为1.0％的PS的PBS，将新生儿脐带用组织剪剪成长度5cm的若干段水平放入大皿，用1ml枪尖吸取大皿中的液体冲洗脐带表面，直至将脐带表面的血液冲洗干净，备用；
[0046]用有齿镊从脐带一端逐步朝另一端撕开包裹在脐静脉外层的华通胶(撕开的宽度1cm，长度5cm，图1A，B本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从人脐带静脉获得人静脉内皮细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将脐带剪成3～5cm的脐带段，冲洗后，备用；(2)剪开所述脐带段后暴露脐静脉，去除周边组织并清洗至无血液后备用；(3)用镊子提取步骤(2)处理后的脐静脉开口一侧，灌注I型胶原酶进行消化；(4)用完全培养基冲洗步骤(3)消化后的脐静脉，收集冲洗液；(5)将所述冲洗液离心，收集细胞沉淀，用完全培养基重悬所述细胞沉淀，得到细胞悬液；(6)将所述细胞悬液进行培养，传代，得到纯化的人静脉内皮细胞。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冲洗是用试剂为含有1.0％(v/v)PS的PBS。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的I型胶原酶的浓度为1.0mg/ml，所述I型胶原酶的用量为灌注至I型胶原酶从脐静脉另一端流出为止。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述消化的温度为37℃；所述消化的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张莹莹，李娜，印永祥，胡玲莉，李京阳，顾颖，徐智策，
申请(专利权)人：无锡市妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：