一种人源性肺纤维化芯片模型的构建方法技术

本申请提供一种人源性肺纤维化芯片模型的构建方法，其包括以下步骤：(1)构建肺芯片；(2)确认细胞生长状况，在芯片中输入含有转化生长因子的促细胞纤维化培养基以诱导细胞纤维化；(3)动态灌注所述转化生长因子预设时间后，获得人源性肺纤维化芯片模型。本申请利用人源性细胞系，实现芯片内细胞外基质及多种细胞的定向培养，同时整合微流体及气液界面，高保真模拟肺局部微环境，高度还原肺局部微环境对肺纤维化的发生发展产生的作用，充分表征肺纤维化疾病的特征，有效缩短时间成本和经济成本。本。本。

【技术实现步骤摘要】
一种人源性肺纤维化芯片模型的构建方法


[0001]本申请涉及生物医学工程
，尤其涉及一种人源性肺纤维化芯片模型的构建方法。

技术介绍

[0002]肺纤维化包括以进行性纤维化为特征的几种肺部疾病，其中特发性肺纤维化(IPF)尤其严重，诊断后中位生存时间为3
‑
5年，目前FDA批准用于治疗IPF的药物仅两种，且这两种药物只能延缓疾病进展，不能逆转纤维化。尽管一些药物的抗纤维化作用在2D细胞培养、3D模型、博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中得到证实，但只有少数化合物在临床试验中显示出其对IPF的有益作用，可能归结于2D细胞培养结构简单，3D模型缺乏组织
‑
组织界面、机械信号和液体流动，动物模型存在种属差异，从而导致药物进入临床的高失败率。自全球面临新冠病毒感染以来，COVID
‑
19相关肺纤维化将肺纤维化相关的研究推向了新的的研究热潮，肺纤维化疾病缺乏有效的逆转纤维化重建肺功能的药物，开发新的有效治疗肺纤维的药物迫在眉睫。用于药物测试的临床前模型中，主流的博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型存在种属差异、诱导周期长、花费高及纤维化自发消退的缺点，因此构建更可靠的肺纤维化模型具有重要的临床意义。
[0003]器官芯片微流体培养装置代表了最近在寻找可以概括器官水平甚至生物体水平功能的体外人体微生理系统方面取得的成功之一。这种微流体形式的微生理系统有各种大小和形状，但它们都包含中空通道，内衬活细胞和在动态流体流动下培养的组织。重建器官的关键结构(例如，组织
‑<br/>组织界面)并提供模拟器官生理学和疾病状态所必需的相关机械力(例如，呼吸和蠕动样运动、肺组织的拉伸力、血管组织的血流动力学剪切力)，可以高保真地模拟器官水平的生理微环境。
[0004]肺芯片用于肺纤维化的疾病建模尚处于初步探索阶段，目前为止，并未有完全符合肺纤维化疾病的模型，一是归因于疾病本身的复杂性，其次是用器官芯片来模拟疾病的发生发展还有很大的进步空间，再者没有统一的诱导肺纤维化芯片模型的方案，需要我们不断地去完善。

技术实现思路

[0005]本申请的目的旨在提供一种基于TGF
‑
β1作为诱导肺纤维化的充分和必要条件的人源性肺纤维化芯片模型的构建方法，其具有能够利用人源性细胞系，对芯片内细胞外基质及多种细胞进行定向培养，同时整合微流体及气液培养界面，来高度还原肺局部微环境对肺纤维化发生发展的的作用的效果。
[0006]为了实现上述目的，本申请提供以下技术方案：
[0007]一种人源性肺纤维化芯片模型的构建方法，其包括以下步骤：
[0008](1)构建肺芯片；
[0009](2)确认细胞生长状况，在芯片中输入含有转化生长因子的促细胞纤维化培养基
以诱导细胞纤维化；
[0010](3)动态灌注所述转化生长因子预设时间后，获得人源性肺纤维化芯片模型。
[0011]进一步设置：所述步骤(1)的构建肺芯片包括以下步骤：
[0012]组装具有上、下两层通道的芯片，在芯片内预充培养基并排除空气泡；
[0013]倒置芯片，将用基质凝胶包裹的人肺成纤维细胞种入芯片的原下通道内，待人肺成纤维细胞贴壁后以人肺成纤维细胞的培养基进行动态培养；
[0014]保持芯片倒置，在芯片的原下通道内再种入人脐静脉细胞融合细胞，待人脐静脉细胞融合细胞贴壁后，在芯片的原上通道内输入人肺成纤维细胞的培养基，在芯片原下通道内输入人脐静脉细胞融合细胞专用培养基；
[0015]正置芯片，在芯片的上通道内种入人肺泡上皮细胞，待人肺泡上皮细胞贴壁后，在芯片上通道输入人肺泡上皮细胞的培养基，在芯片下通道输入人肺成纤维细胞的培养基和人脐静脉细胞融合细胞专用培养基的混合培养基；
[0016]待达到预设时间后，将芯片细胞培养方式更改为气液培养，把芯片的上通道内的液体排空后，封闭芯片上通道的出入口，并在芯片的下通道通入上述人肺成纤维细胞的培养基、人脐静脉细胞融合细胞专用培养基及人肺泡上皮细胞的培养基的混合培养基对细胞进行培养；
[0017]上述步骤中种入细胞均需要间隔24h。
[0018]进一步设置：所述组装具有上、下两层通道的芯片包括：
[0019]准备微流控芯片及Transwell细胞培养板；
[0020]用小刀沿Transwell细胞培养板的边缘平整地割下聚酯膜，并用镊子夹取聚酯膜平铺在打开的微流控芯片的中央，以将微流控芯片分隔为上、下通道；
[0021]芯片的上、下通道均设有入口端和出口端，两个入口端分别通过出入口管道连接注射器，两个出口端分别通过出入口管道连接废液收纳瓶；
[0022]将微流控芯片置于夹具内并固定。
[0023]进一步设置：所述人肺成纤维细胞专用培养基为10％胎牛血清、1％青
‑
链霉素的MEM培养基；
[0024]所述人肺泡上皮细胞的培养基为含有10％胎牛血清、1％青
‑
链霉素的Ham
’
s F
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12K培养基。
[0025]进一步设置：人肺成纤维细胞种入倒置芯片的原下通道后，翻转芯片并将芯片放入培养箱内并静置4
‑
6h后，以1.4μl/min的速度在芯片的上、下通道泵注MEM完全培养基。
[0026]进一步设置：人脐静脉细胞融合细胞种入倒置芯片的原下通道后，将芯片放入培养箱内静置4
‑
6h后开始泵注培养基，以1.4μl/min的速度在芯片的上通道泵注人肺成纤维细胞的培养基和在下通道泵注人脐静脉细胞融合细胞专用培养基。
[0027]进一步设置：在种入人肺泡上皮细胞前，在芯片的上通道内通入0.6ml的人肺成纤维细胞的培养基，并放入培养箱内静置4h；
[0028]在正置芯片的上通道种入人肺泡上皮细胞后，放入培养箱静置4
‑
6h后，以1.4μl/min的速度在芯片的上通道内泵注F
‑
12K完全培养基，并以1.4μl/min的速度在芯片的小通道泵注含有人肺成纤维细胞的培养基和人脐静脉细胞融合细胞专用培养基的混合培养基，且人肺成纤维细胞的培养基和人脐静脉细胞融合细胞专用培养基的质量比为1:1。
[0029]进一步设置：芯片进行气液培养时，芯片下通道泵注的培养基为质量比为1:1:1的MEM完全培养基、人脐静脉细胞融合细胞专用培养基及F
‑
12K完全培养基的混合培养基。
[0030]进一步设置：所述步骤(2)中含有转化生长因子的促细胞纤维化培养基为含TGF
‑
β1的培养基，TGF
‑
β1的浓度为10ng/ml。
[0031]进一步设置：所述步骤(3)中动态灌注所述转化生长因子包括：
[0032]以1.4μl/min的速度将转化生长因子泵注到步骤(1)构建好的肺芯片的下通道内，以诱导细胞纤维化；
[0033]对所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人源性肺纤维化芯片模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建肺芯片；(2)确认细胞生长状况，在芯片中输入含有转化生长因子的促细胞纤维化培养基以诱导细胞纤维化；(3)动态灌注所述转化生长因子预设时间后，获得人源性肺纤维化芯片模型。2.根据权利要求1所述的一种人源性肺纤维化芯片模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)的构建肺芯片包括以下步骤：组装具有上、下两层通道的芯片，在芯片内预充培养基并排除空气泡；倒置芯片，将用基质凝胶包裹的人肺成纤维细胞种入芯片的原下通道内，待人肺成纤维细胞贴壁后以人肺成纤维细胞的培养基进行动态培养；保持芯片倒置，在芯片的原下通道内再种入人脐静脉细胞融合细胞，待人脐静脉细胞融合细胞贴壁后，在芯片的原上通道内输入人肺成纤维细胞的培养基，在芯片的原下通道内输入人脐静脉细胞融合细胞专用培养基；正置芯片，在芯片的上通道内种入人肺泡上皮细胞，待人肺泡上皮细胞贴壁后，在芯片上通道输入人肺泡上皮细胞的培养基，在芯片下通道输入人肺成纤维细胞的培养基和人脐静脉细胞融合细胞专用培养基的混合培养基；待达到预设时间后，将芯片细胞培养方式更改为气液培养，把芯片的上通道内的液体排空后，封闭芯片上通道的出入口，并在芯片的下通道通入上述人肺成纤维细胞的培养基、人脐静脉细胞融合细胞专用培养基及人肺泡上皮细胞的培养基的混合培养基对细胞进行培养；上述步骤中种入细胞均需要间隔24h。3.根据权利要求2所述的一种人源性肺纤维化芯片模型的构建方法，其特征在于，所述组装具有上、下两层通道的芯片包括：准备微流控芯片及Transwell细胞培养板；用小刀沿Transwell细胞培养板的边缘平整地割下聚酯膜，并用镊子夹取聚酯膜平铺在打开的微流控芯片的中央，以将微流控芯片分隔为上、下通道；微流控芯片的上、下通道均设有入口端和出口端，两个入口端分别通过出入口管道连接注射器，两个出口端分别通过出入口管道连接废液收纳瓶；将微流控芯片置于夹具内并固定。4.根据权利要求2所述的一种人源性肺纤维化芯片模型的构建方法，其特征在于，所述人肺成纤维细胞专用培养基为含有10％胎牛血清、1％青
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链霉素的MEM培养基；所述人肺泡上皮细胞的培养基为含有10％胎牛血清、1％青
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链霉素的Ham
’
s F
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12K培养基。5.根据权利要求2所述的一...

【专利技术属性】
技术研发人员：周树勤，曾佑敏，彭青，董尚奇，叶亮，金美先，
申请(专利权)人：南方医科大学珠江医院，
类型：发明
国别省市：