一种修复表皮创面的诱导乳腺上皮细胞外泌体及复合物制造技术

本发明专利技术提供了一种修复表皮创面的诱导乳腺上皮细胞外泌体及复合物，外泌体的获得包括诱导乳腺上皮细胞的获得以及诱导乳腺上皮细胞外泌体的提取两个步骤。本发明专利技术中，运用诱导乳腺上皮细胞的细胞外泌体作用于皮肤创伤部位，促进表皮细胞的修复与增殖，加速创面再上皮化，对于创面的快速愈合以及机体免疫力的恢复具有一定的应用价值。细胞外泌体与凝胶相结合的方式提高给药效率，加速创面的愈合。加速创面的愈合。加速创面的愈合。

【技术实现步骤摘要】
一种修复表皮创面的诱导乳腺上皮细胞外泌体及复合物


[0001]本专利技术属于生物
，尤其是涉及一种修复表皮创面的诱导乳腺上皮细胞外泌体及复合物。

技术介绍

[0002]皮肤是人体的重要保护层，由物理、化学、生物等因素造成的全层皮肤受损难以通过正常的修复机制恢复机体功能，给人们带来严重的身心健康问题，并给社会造成严重的经济损失。干细胞疗法是近年来创伤修复领域中新兴的治疗方式，目前，大量研究表明间充质干细胞可通过直接转移或嵌入支架中递送至伤口部位，分泌细胞因子以减轻炎症，刺激血管生成从而导致伤口更快地闭合。
[0003]目前，间充质干细胞的临床应用可能受到致瘤性、异物组织形成和植入细胞存活率低的潜在风险的限制。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术旨在提出一种修复表皮创面的诱导乳腺上皮细胞外泌体及复合物，以克服现有技术的不足，运用诱导乳腺上皮细胞的细胞外泌体对表皮创面进行修复，同时提供一种稳定性好，给药效率高的技术方案。
[0005]为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0006]一种修复表皮创面的诱导乳腺上皮细胞外泌体，其获得包括诱导乳腺上皮细胞的获得以及诱导乳腺上皮细胞外泌体的提取两个步骤，其中诱导乳腺上皮细胞通过如下方法获得，将成纤维细胞(Fibroblasts)培养于无外泌体但含胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(体积百分比10％ FBS+DMEM)，于37℃，5％ CO2的细胞培养箱中孵育，待细胞密度达到40
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60％时，将DMEM培养基更换为N2B27+5
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100μM RepSox培养基，每2d更换一次诱导培养基并收集0、2、4、6、8d的细胞上清液各2ml混合于15ml离心管中进行外泌体的提取；其中N2B27培养基包括Knockout DMEM/F12、KSR、N2、Neurobasal、B27，各物质的体积比为40:20:0.4:40:0.8。
[0007]一种修复表皮创面的诱导乳腺上皮细胞外泌体，其获得包括诱导乳腺上皮细胞的获得以及诱导乳腺上皮细胞外泌体的提取两个步骤，其中诱导乳腺上皮细胞通过如下方法获得，将敲除TGFβR1的成纤维细胞(Fibroblasts)培养于DMEM培养液中，于37℃，5％ CO2的细胞培养箱中孵育，待细胞密度达到40
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60％时，将DMEM培养基更换为N2B27基础培养基，直至出现克隆现象为止，收集期间的细胞上清液进行外泌体的提取；其中N2B27培养基包括Knockout DMEM/F12、KSR、N2、Neurobasal、B27，各物质的体积比为40:20:0.4:40:0.8。
[0008]优选的，成纤维细胞为奶山羊的成纤维细胞(GEFs)。
[0009]优选的，诱导乳腺上皮细胞外泌体的提取采用差速离心法，具体方法如下，使用离心机在4℃条件下，300g离心10min去除完整细胞。4℃，2000g离心10min去除死细胞。4℃，10000g离心30min除去凋亡小体，并于0.22μm滤器过滤细胞上清。之后将细胞上清转移至超离管，4℃，100000g离心70min，除去上层清液，再用PBS缓冲液将底层沉淀物重新悬浮。重复
上一步骤，用100μL PBS重新悬浮沉淀后将其转移至无菌EP管中。BCA法测定蛋白浓度后置于
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80℃冰箱中保存。
[0010]本专利技术同时提供一种修复表皮创面的诱导乳腺上皮细胞外泌体复合物，包括如上所述的修复表皮创面的诱导乳腺上皮细胞外泌体；诱导乳腺上皮细胞外泌体与壳聚糖温敏凝胶复合，两者的体积比为1:2
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4。
[0011]优选的，壳聚糖温敏凝胶的制备包括如下步骤，称取1.5g的壳聚糖(CS)粉末，溶解于55mL 0.1mol/L乙酸溶液中，磁力搅拌2h充分使其溶解，以制备得到CS溶液；同样，将2.5g的β
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甘油磷酸钠(β
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GP)溶于5.5mL去离子水中，添加0.28g的NaHCO3粉末后超声溶解，待粉末完全溶解后通过0.22μm滤器过滤；最后，在冰板上将含有NaHCO3的β
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GP溶液滴加至CS溶液中，充分磁力搅拌10min以得到均匀的CS
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Gel，于40℃冰箱保存。
[0012]本专利技术也提供一种如上所述的诱导乳腺上皮细胞外泌体在制备修复表皮创面药物或护理品中的应用。
[0013]本专利技术也提供一种如上所述的诱导乳腺上皮细胞外泌体复合物在制备修复表皮创面药物或护理品中的应用
[0014]相对于现有技术，本专利技术所述的修复表皮创面的诱导乳腺上皮细胞外泌体及复合物，具有以下优势：
[0015]细胞外泌体(Exosomes，Exo)是负责细胞旁分泌作用的关键活性囊泡，携带来源细胞的多种活性成分，包括细胞因子、生长因子、mRNA、脂质和蛋白质，介导创伤修复的各个过程。外泌体来源充足，易处理及储存，无免疫原性，在组织再生领域具有良好的应用前景。
[0016]本专利技术中，运用诱导乳腺上皮细胞(Induce mammary epithelial cells，iMECs)的细胞外泌体作用于皮肤创伤部位，促进表皮细胞的修复与增殖，加速创面再上皮化，对于创面的快速愈合以及机体免疫力的恢复具有一定的应用价值；
[0017]本专利技术中，将提取到的iMECs中细胞外泌体与壳聚糖温敏凝胶相结合，制备得到诱导乳腺上皮细胞外泌体
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壳聚糖温敏凝胶复合物(iMECs
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Exo@CS
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Gel)涂抹于损伤皮肤处用于表皮创面的治疗，以一种新型的细胞外泌体与凝胶相结合的方式提高给药效率，促进创面再上皮化，加速创面的愈合。
[0018]本专利技术中，诱导乳腺上皮细胞外泌体
‑
壳聚糖温敏凝胶复合物，能够提高外泌体的稳定性，帮助长期释放外泌体，并为细胞浸润和粘附提供临时的细胞外基质，加速创面再上皮化，为创伤修复治疗提供了一种新的方法。
附图说明
[0019]图1为iMECs
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Exo粒径分布及大小结果；
[0020]图2为iMECs
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Exo透射电镜结果；
[0021]图3为CS
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Gel在40℃和37℃条件下的相变；
[0022]图4为iMECs
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Exo在CS
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Gel中的保留行为；
[0023]图5为iMECs
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Exo在CS
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Gel中的体外释放；
[0024]图6为不同浓度iMECs
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Exo@CS
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Gel对IMECs增值能力的影响；
[0025]图7为不同浓度iMECs
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Exo@CS
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Gel对GEFs增值能力的影响；
[0026]图8为不同浓度iMECs...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种修复表皮创面的诱导乳腺上皮细胞外泌体，其特征在于：其获得包括诱导乳腺上皮细胞的获得以及诱导乳腺上皮细胞外泌体的提取两个步骤，其中诱导乳腺上皮细胞通过如下方法获得，将成纤维细胞(Fibroblasts)培养于无外泌体但含胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(体积百分比10％FBS+DMEM)，于37℃，5％CO2的细胞培养箱中孵育，待细胞密度达到40
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60％时，将DMEM培养基更换为N2B27+5
‑
100μM RepSox培养基，每2d更换一次诱导培养基并收集0、2、4、6、8d的细胞上清液各2ml混合于15ml离心管中进行外泌体的提取；其中N2B27培养基包括Knockout DMEM/F12、KSR、N2、Neurobasal、B27，各物质的体积比为40:20:0.4:40:0.8。2.一种修复表皮创面的诱导乳腺上皮细胞外泌体，其特征在于：其获得包括诱导乳腺上皮细胞的获得以及诱导乳腺上皮细胞外泌体的提取两个步骤，其中诱导乳腺上皮细胞通过如下方法获得，将敲除TGFβR1的成纤维细胞(Fibroblasts)培养于DMEM培养液中，于37℃，5％CO2的细胞培养箱中孵育，待细胞密度达到40
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60％时，将DMEM培养基更换为N2B27基础培养基，直至出现克隆现象为止，收集期间的细胞上清液进行外泌体的提取；其中N2B27培养基包括Knockout DMEM/F12、KSR、N2、Neurobasal、B27，各物质的体积比为40:20:0.4:40:0.8。3.根据权利要求1或2所述的修复表皮创面的诱导乳腺上皮细胞外泌体，其特征在于：成纤维细胞为奶山羊的成纤维细胞(GEFs)。4.根据权利要求1或2所述的修复表皮创面的诱导乳腺上皮细胞外泌体，其特征在于，诱导乳腺上皮细胞外...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄奔，潘思尧，张丹丹，刘思漪，霍守雨，谢小莲，
申请(专利权)人：广西犇彭生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：