一种通过降低TGFβR1表达促使体细胞重编程为乳腺上皮细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种通过降低TGFβR1表达促使体细胞重编程为乳腺上皮细胞的方法，本发明专利技术可以利用基因调控的方法直接降低TGFβR1基因表达在4

【技术实现步骤摘要】
一种通过降低TGF
β
R1表达促使体细胞重编程为乳腺上皮细胞的方法


[0001]本专利技术属于生物
，尤其是涉及一种通过降低TGFβR1表达促使体细胞重编程为乳腺上皮细胞的方法。

技术介绍

[0002]目前，已经建立了小分子化合物诱导体细胞重编程为乳腺上皮细胞的技术体系。该体系能够在使用一个小分子化合物的条件下诱导体细胞重编程为乳腺上皮细胞，诱导时间仅需要4
‑
8天，诱导效率为3％左右。通过小分子化合物等方法来抑制体细胞TGFβR1的表达都可以得到这一重编程现象，从而获得诱导乳腺上皮细胞。
[0003]目前的技术方法在体内应用于体细胞重编程为乳腺上皮细胞中，可能不利于原位定点的诱导体细胞重编程为乳腺上皮细胞，体内诱导可控性相对较低，具有一定的潜在副作用。同时在分离纯化小分子化合物诱导乳腺上皮细胞代谢产物时，添加的小分子化合物可能会对分离和纯化造成一定影响。
[0004]因此，需要多样化的调控体内细胞重编程为乳腺上皮细胞的方法手段，为快速获得纯净的乳腺上皮细胞提供多种可供选择的技术和研究路径。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术旨在提出一种通过基因调控的方法直接下调TGFβR1基因表达诱导体细胞重编程为乳腺上皮细胞的方法，本专利技术可以利用降低TGFβR1基因表达在4
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8天内将体细胞诱导重编程为乳腺上皮细胞，可应用于高效精准的调控体内特定组织细胞重编程为乳腺上皮细胞，更加有利于体内乳腺再生与修复。也能够更加方便高效的分离纯化得到诱导乳腺上皮细胞的分泌物，排除小分子化合物的影响。
[0006]本专利技术首先提供了降低TGFβR1基因表达在诱导体细胞重编程为乳腺上皮细胞方面的用途。
[0007]优选的，所述体细胞为山羊成纤维细胞。
[0008]降低TGFβR1基因表达的方式有很多，包括但不限于，基因敲除、基因敲低、或干扰基因中的一种。
[0009]优选的，降低TGFβR1基因表达的方法，包括以下步骤，1)TGFβR1基因敲除、敲低或干扰载体的构建；参考NCBI上山羊TGFβR1序列信息，针对CDS区设计引物序列。载体引入酶切位点，将目的片段与载体进行连接，装入慢病毒敲除、敲低或者干扰质粒载体，测序确认。
[0010]2)利用包装了TGFβR1基因敲除、敲低或者干扰载体的慢病毒感染体细胞；
[0011]3)诱导乳腺上皮细胞；
[0012]上述细胞在饱和湿度5％CO2，37℃培养箱中，使用N2B27培养4
‑
8天，可获得山羊诱导乳腺上皮细胞(TGFβR1
‑
iMECs)。
[0013]优选的，步骤2)中，通过以下方法获得敲除、敲低或者干扰TGFβR1基因表达的体细
胞，
[0014]a、将慢病毒重组质粒与病毒包膜质粒VSVG、包装质粒NRF共转染293T细胞，转染后8h更换为成纤维细胞培养基(DMEM+体积分数10％FBS)，培养48
‑
72h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，用0.45μm滤膜过滤后备用其中重组质粒为TGFβR1基因敲除、敲低或者干扰质粒；
[0015]b、用步骤a的病毒液感染体细胞；将病毒液和培养基混合后感染山羊成纤维细胞(GEFs)，48h后观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达，然后加3ug/ml嘌呤霉素进行筛选，连续筛选3天即可获得稳定的敲除，敲低或者干扰TGFβR1基因表达的山羊成纤维细胞。
[0016]优选的，步骤3)中，诱导培养基为N2B27，包括KnockoutDMEM/F12、N2(100
×
)、Neurobasal、B27(50
×
)、Knockout serum replacement、L
‑
Glutamine(100
×
)。
[0017]优选的，KnockoutDMEM/F12、N2(100
×
)、Neurobasal、B27(50
×
)、Knockout serum replacement、L
‑
Glutamine(100
×
)体积比为39.6:0.4:39.2:0.8:19:1。
[0018]一种下调TGFβR1表达诱导体细胞重编程为乳腺上皮细胞的方法，利用基因调控技术直接降低TGFβR1基因表达为基因敲除、基因敲低、或干扰基因中的一种。
[0019]本专利技术填补了利用基因操作技术降低一个关键基因表达诱导成纤维细胞向乳腺上皮细胞转分化技术的一个空白。可以为体内精准定位治疗乳腺相关疾病以及乳腺组织重构再生提供新的技术手段。为更加简便高效利用诱导乳腺上皮细胞代谢产物提供新的技术手段。
附图说明
[0020]构成本专利技术的一部分的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：
[0021]图1为敲除TGFβR1基因诱导成纤维细胞重编程为乳腺上皮细胞形态图；
[0022]左图：GEFs
‑
空载在N2B27培养八天的细胞形态图。右图：敲除TGFβR1基因的成纤维细胞在N2B27培养八天重编程为乳腺上皮细胞的形态图。标尺，100um。
[0023]图2为敲除TGFβR1基因诱导成纤维细胞重编程为乳腺上皮细胞的免疫荧光染色图。Ko
‑
TGFβR1
‑
iMECs表达乳腺上皮细胞标记蛋白，CDH1，CD49f，CK8，CK18和CK19。对照组细胞(GEFs
‑
空载
‑
N2B27)不表达上述标记蛋白。
具体实施方式
[0024]需要说明的是，在不冲突的情况下，本专利技术创造中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0025]下面将参考附图并结合实施例来详细说明本专利技术创造。
[0026]通过敲除TGFβR1(Knockout TGFβR1)的方法已成功将关中奶山羊的体细胞转化为具有泌乳功能的乳腺上皮细胞。
[0027]具体操作如下：
[0028]1、敲除TGFβR1载体的构建与鉴定
[0029]1.1sgRNA的设计及引物合成
[0030]根据GenBank上提供的山羊TGFβR1基因编码序列，利用在线网站设计sgRNA序列，
sgRNA序列设计以NGG的PAM原则为基准并利用网络工具进行脱靶位点分析，优选3条sgRNA，根据sgRNA序列进行引物合成。详细序列见表1、表2。
[0031]表1sgRNA序列信息
[0032][0033]成oligo信息
[0034][0035]1.2RNA的提取及cDNA的合成
[0036](1)总RNA提取。去掉培养基用PBS洗三次，加入1ml预冷的TRIZOL裂解液，吹打混匀后冰上放置5min，使之充分裂解本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.降低TGFβR1基因表达在诱导体细胞重编程为乳腺上皮细胞方面的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述体细胞为山羊成纤维细胞。3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：利用基因调控技术直接降低TGFβR1基因表达为基因敲除、基因敲低、或干扰基因中的一种。4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：利用基因调控技术直接降低TGFβR1基因表达的方法，包括以下步骤，1)TGFβR1基因敲除、敲低或干扰载体的构建；2)利用包装了TGFβR1基因敲除、敲低或者干扰载体的慢病毒感染体细胞；3)诱导乳腺上皮细胞。5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：步骤2)中，通过以下方法获得敲除，敲低或者干扰TGFβR1基因表达的体细胞，a、将慢病毒重组质粒与病毒包膜质粒VSVG、包装质粒NRF共转染293T细胞，其中重组质粒为TGFβR1基因敲除、敲低或者干扰质粒；b、用步骤a的病毒液感染体细胞。6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：步骤3)中，诱导培养基为N2B2...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄奔，张丹丹，刘权辉，刘思漪，王国栋，覃梁珊，
申请(专利权)人：广西犇彭生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：