一种体外高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种体外高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的方法，通过小分子化合物、基因干扰、基因过表达上调PKA、CREB位点的表达。本专利诱导小分子化合物单一和安全，诱导时间短、诱导效率高、诱导作用位点和基因明确以及分子调控机制清楚，可以将其应用于人神经退行性疾病的临床治疗中，为神经退行性疾病的治疗提供一种更加安全高效的治疗手段。由于神经元没有分裂增殖能力，因此我们利用本专利可以将有分裂增殖能力的成纤维细胞在体内外进行诱导，源源不断的在体内外获得大量的诱导神经元。神经元。神经元。

【技术实现步骤摘要】
一种体外高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的方法


[0001]本专利技术属于干细胞领域，尤其是涉及一种体外高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的方法。

技术介绍

[0002]利用转染外源转录因子以及小分子化合物组合等诱导方法，在人、小鼠等多个物种均已经实现将终末分化体细胞重编程为神经元。2015年裴钢课题组报道了利用7个小分子化合物组合，将阿尔茨海默症患者的成纤维细胞重编程为神经元。2005年Brueckner B等利用6种小分子化合物的组合，将人星形胶质细胞诱导为神经元。这些小分子化合物抑制了非神经元基因的表达，促进神经元特异基因的表达，通过对于诱导后细胞的延长培养，最终获得成熟的功能性神经元。
[0003]虽然现在诱导神经元的方法种类有很多，但是均存在诱导时间过长(20～30天)，诱导效率偏低(10％～30％)，方法过度繁琐以及潜在的生物安全风险偏高等缺点。在细胞治疗应用方面来看，现有技术由于使用的诱导因素过多、诱导时间过长、效率偏低都会大大降低临床治疗的效果，增加潜在的治疗副作用以及生物安全性的担忧。在机理方面来说，现有的技术是使用多种小分子化合物的联合作用，作用的信号通路交错，作用位点繁杂，无法准确揭示体细胞向神经元命运的转化是如何决定的。目前没有任何技术阐述可以利用单一小分子化合物将体细胞重编程为神经元细胞，并且也未能完全阐明体细胞重编程为神经元的机理。
[0004]而本专利技术的诱导体系可以在只使用单个小分子化合物或者单一基因的调控作用的前提下两天内将体细胞重编程为具有TUJ1阳性的神经元细胞(最高阳性率约80％)。更重要的是，前人使用的小分子化合物组合的方法无法阐述细胞命运转化的机理。我们的发现清楚的阐明了人体细胞重编程为神经元细胞的分子调控路径，确定了单一小分子化合物或者单一基因的调控作用可以诱导人体细胞重编程为神经元细胞。另外本专利技术中提到的重编程的关键调控位点前人都还没有报道。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术旨在提出一种体外高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的方法，以克服现有技术的缺陷,确定了单一小分子化合物或者单一基因的调控作用可以诱导人体细胞重编程为神经元细胞。
[0006]一种高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的方法，提高cAMP的浓度或上调PKA、CREB任一位点的表达或抑制AMPK、ALK2、ALK3、P38、JNK任一位点的表达。
[0007]优选地，使用小分子化合物、基因干扰、基因敲除或基因过表达提高cAMP的浓度或上调PKA、CREB任一位点的表达或抑制AMPK、ALK2、ALK3、P38、JNK任一位点的表达，优选地，小分子化合物包括cAMP激活剂、cAMP、cAMP类似物、PKA激活剂、CREB激活剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂中的一种或两种以上。
[0008]诱导人体细胞重编程为神经元细胞的各作用位点及作用该位点的小分子化合物，作用位点包括cAMP(提高浓度),PKA(激活/上调表达)，CREB(激活/上调表达)，ALK2/3(抑制/下调表达)，JNK(抑制/下调表达),P38(抑制/下调表达),AMPK(抑制/下调表达)。下列任何单一小分子化合物，包括(不仅限于)cAMP/PKA/CREB激活剂(Forskolin/Colforsin/8
‑
Bromo
‑
cAMP/Dibutyryl
‑
cAMP(Bucladesine)/cAMP及其类似物等)，ALK2/3抑制剂(LDN
‑
193189/LDN
‑
193189
‑
2HCl/K02288/LDN
‑
212854/LDN
‑
214117/ML347/DMH1/等)，JNK抑制剂(SP600125/Resveratrol/JNK
‑
IN
‑
8/JNK
‑
InhibitorVIII/DB07268/IQ
‑
1S/Bentamapimod(AS602801)/Tanzisertib(CC
‑
930)/BI
‑
78D3/JNK InhibitorIX/UrolithinB/LoureirinB/LoureirinB/Falcarindiol/CucurbitacinIIb/MulberrosideA/Trans
‑
ZeatinAstragaloside IV等)，P38抑制剂(SB203580/Doramapimod(BIRB796)/SB202190(FHPI)/Ralimetinib dimesylate/VX
‑
702/PH
‑
797804/VX
‑
745/TAK
‑
715/PD169316/TA
‑
02/SD0006/Pamapimod/BMS
‑
582949/SB239063/Losmapimod(GW856553X)/Skepinone
‑
L/SEA0400/AUDA/PraeruptorinA/MulberrosideA/UM
‑
164/Trans
‑
Zeatin/3'
‑
Hydroxypterostilbene/P exmetinib(ARRY
‑
614)等)，AMPK抑制剂(Dorsomorphin/WZ4003/ON123300/HTH
‑
01
‑
015/GSK690693/XMD
‑
17
‑
51/Dorsomorphin(CompoundC)/Dorsomorphin(CompoundC)2HCl/Doxorubicin(Adriamycin)HCl等)，都可以诱导人皮肤成纤维细胞、人卵泡颗粒细胞、人星形胶质细胞等体细胞重编程为功能性神经元的方法。
[0009]本专利技术的第二目的在于提供一种用于高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的诱导培养基，包括基础液、KSR以及小分子化合物，优选地，小分子化合物包括cAMP激活剂、cAMP、cAMP类似物(如DBcAMP、8
‑
Cl
‑
cAMP等)、PKA激活剂、CREB激活剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂中的一种或两种以上。
[0010]优选地，小分子化合物包括Forskolin、8
‑
Bromo
‑
cAMP、LDN193189、cAMP、cAMP类似物、SP600125、SB203580、Dorsomorphin，且在最终培养基中，各自的浓度依次分别为0
‑
100μM、0
‑
500μM、0
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种体外高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的方法，其特征在于：上调PKA、CREB任一位点的表达，所述体细胞为皮肤成纤维细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：使用小分子化合物、基因干扰、基因过表达上调PKA、CREB任一位点的表达，优选的，小分子化合物包括PKA激活剂或CREB激活剂。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：使用诱导培养基进行体外高效诱导体细胞重编程为神经元细胞，所述诱导培养基包括基础液、KSR以及小分子化合物，优选的，小分子化合物包括PKA激活剂或CREB激活剂。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：小分子化合物包括8
‑
Bromo
‑
cAMP，且在最终培养基中，浓度依次为0
‑
500μM，优选的，小分子化合物的浓度为5
‑
50μM。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：小分子化合物的浓度为50μM。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：基础液、KSR的体积比为80:20。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：基础液为N2B27，包括Knockout DMEM/F12、N2(100
×
)、Neurobasal、B27(50
×
)、Glutamine(100
×
)；且几者的体积比为99:1:97:2:1。8.一种使用诱导培养基进行体外诱导体细胞重编程为神经元细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：1)将体细胞接种于培养皿中，接种后加入高糖DMEM+10％FBS，置于5％二氧化碳，湿度9...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄奔，王国栋，张丹丹，刘权辉，吴玉莲，吕丹薇，胡吉刚，谢小莲，
申请(专利权)人：广西犇彭生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：