一种产生中型多棘神经元的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，更具体地，本发明专利技术涉及利用一种诱导NPC为MSN的方法。所述产生MSN的方法，包括在NPCs中表达外源的以下转录因子或sgRNA：ASCL1、NGN2、miR

【技术实现步骤摘要】
一种产生中型多棘神经元的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，更具体地，本专利技术涉及利用一种诱导NPC为MSN的方法。

技术介绍

[0002]人多能干细胞(hPSCs；包括人胚胎干细胞hESCs和人诱导多能干细胞hiPSCs)是研究各种人类遗传性疾病，包括神经退行性疾病的重要模型。由hPSCs分化的神经前体细胞(NPCs)能够进一步分化为神经元和胶质细胞，对神经退行性疾病的发病机制研究及疾病标志物筛查、药物筛选以及细胞移植治疗等具有广泛而重要的作用。
[0003]亨廷顿舞蹈病(HD)是一种遗传性神经退行性疾病，以进行性运动障碍、精神和认知症状为主要特征。大脑纹状体中γ
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氨基丁酸(GABA)能型中型多棘神经元(MSN)的缺失是HD的重要病理标志。因此，利用hPSCs来源的NPCs或者MSN进行细胞移植是一种很有前景的HD治疗策略，同时也为阐明HD的新病理机制提供了重要的细胞模型和细胞平台。基于hPSC及其神经分化的HD治疗的主要目标是补充患者损失的MSN，从而缓解神经元的功能障碍和死亡带来的相关临床表现。
[0004]利用hPSCs分化为神经元的通用策略：hPSCs体外分化为神经元通常遵循神经元体内发育的一个多步骤过程：即i)诱导神经谱系；
ⅱ
)NPC分化；iii)成熟神经元亚型的特异性分化。因此，在神经发育过程中发挥重要作用的各种转录因子、细胞因子或小分子化合物(包括拮抗剂或激动剂)也用于诱导hPSCs在体外分化为特定的神经表型。例如，添加音猬因子(SHH)、丙戊酸(VPA)、cAMP和抗坏血酸(L
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AA)可有效诱导hESCs分化为功能成熟的MSN。在hPSCs的神经诱导和分化过程中，细胞因子或小分子化合物处理的时间点、持续时间和处理浓度对于获得特定的神经元亚型是十分关键的。例如，使用SHH短时间处理可高效诱导ESCs衍生的NPCs高效分化为多巴胺能神经元。而加入低浓度的SHH可诱导ESCs分化为NESTIN
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NPCs，而后通过转入转录因子LMX1A将其继续分化为TH
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多巴胺能神经元。在适合的时间和浓度窗口添加转录因子及细胞因子或小分子化合物对有效促进hPSC分化为MSN提供了重要的理论依据。
[0005]目前获得MSN的主要方法分为两大类：
[0006]第一类由体细胞如皮肤成纤维细胞或者hPSCs经细胞因子和小分子化合物诱导转分化或者分化为MSN。第二类是由hPSCs开始经转录因子诱导为MSN。现有的利用转录因子组合来诱导hPSCs为MSN的组合NOLZ1(ZNF503)/ISL1，GSX2/EBF1等转录因子组合，但是分化时间较长，一般超过45天，而且诱导MSN的生成效率较低一般不高于50％。2017年报导在hPSC依次使用转录因子GSX2和EBF1感染，第60天CTIP2
+
细胞表达为42.9％，在分化的第80天，DARPP32
+
/CTIP2
+
神经元表达效率为38.8％。但其分化时间长，分化效率低，所得神经元不纯。
[0007]利用转录因子将体细胞直接转分化为神经元目前也有大量的研究报道。例如，最早的研究报道显示，将小鼠成纤维细胞感染转录因子(ASCL1，MYT1L和BRN2)可产生功能性神经元，如表达突触标志物并产生动作电位。同样地，ASCL1、BRN2和MYT1L转录因子在人成
纤维细胞中也可用于直接转分化为功能性神经元。转录因子也用于不同亚型神经元的直接转分化或分化。例如，2014年miR
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9/9*
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124与发育纹状体中富集的转录因子CTIP2、DLX1、DLX2和MYT1L共表达，可以在4周左右诱导人成纤维细胞转化为DARPP32
+
MSN(77％)，但其转化时间较长，效率一般。
[0008]综上，目前hPSCs向MSN分化的方法均尚存在一些缺点，包括分化效率低、耗时长、所得神经元不纯。由于hPSCs神经分化可为神经退行性疾病包括HD的研究提供重要的细胞模型和细胞平台，获得产量高而纯的神经元包括MSN致为关键。另外，由hPSC分化生成的NPC基本上都具有前脑特征，因此基本自发分化为大多数兴奋性和抑制性神经元，但极少分化为与神经退行性疾病损伤的特异性相关的神经元亚型，如HD的MSN。因此，有必要开发和改进MSN神经元分化的技术，提高分化效率及神经元纯度。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的是提供一种高效快速诱导hPSC来源的NPCs产生MSN的方法，与传统方案相比，分化为功能性MSN所需的时间减少、所得MSN的纯度更高、产量更多，有利于开展广泛的疾病模拟和机制研究，以及开展需大量细胞样本的相关实验如质谱分析、免疫共沉淀、二代测序以及细胞移植相关的功能研究等。
[0010]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0011]一种产生MSN的方法，包括在NPCs中表达(包括重组表达或过表达)外源的以下转录因子或sgRNA：ASCL1、NGN2、miR
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9/124、sgPTBP1(sgRNA)、CTIP2、DLX1和DLX2之一或几种组合；其中，所述ASCL1、NGN2、miR
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9/124、sgPTBP1、CTIP2、DLX1和DLX2之一还包括其同源物、类似物或变体。
[0012]优选的，所述转录因子或sgRNA为ASCL1、NGN2、miR
‑
9/124、sgPTBP1、CTIP2、DLX1和DLX2中的三种组合物。
[0013]优选的，所述转录因子为ASCL1、NGN2、CTIP2、DLX1和DLX2中的三种组合物。
[0014]优选的，所述转录因子为ASCL1、CTIP2、DLX1的组合物，ASCL1、CTIP2、DLX2的组合物，NGN2、CTIP2、DLX1的组合物或NGN2、CTIP2、DLX2的组合物。
[0015]上述四组组合物中，均是按1:1:1组合得到。
[0016]优选的，所述NPCs来源于hPSC经SMAD双重抑制诱导分化而来。
[0017]优选的，在NPCs中表达外源的以下转录因子的方法是：(a)提供细胞；(b)用表达载体将所述的转录因子转入(a)的细胞中，或通过蛋白转染将所述的转录因子转入(a)的细胞中；(c)培养(b)获得的细胞。
[0018]优选的，所述表达载体为病毒载体或非病毒载体，包括慢病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体，逆转录病毒载体或非病毒的质粒。
[0019]在本专利技术的另一方面，提供一种MSN或其培养物，其由前面所述的方法获得。
[0020]优选的，所述MSN具有如下一种或多种性能：1)表达MSN的标志分子DARPP32、GAD1、GAD2；2)具备神经元的基本电生理特征，包括：膜阻抗、静息膜电位、在去极化的刺激下能够产生动作电位，并且能够记录到由于钠通道开放而产生本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产生MSN的方法，其特征在于，包括在NPCs中表达外源的以下转录因子或sgRNA：ASCL1、NGN2、miR
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9/124、sgPTBP1、CTIP2、DLX1和DLX2之一或几种组合；其中，所述ASCL1、NGN2、miR
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9/124、sgPTBP1、CTIP2、DLX1和DLX2之一还包括其同源物、类似物或变体。2.根据权利要求1所述的产生MSN的方法，其特征在于，所述转录因子为ASCL1、NGN2、CTIP2、DLX1和DLX2中的三种组合物。3.根据权利要求1所述的产生MSN的方法，其特征在于，所述转录因子为ASCL1、CTIP2、DLX1的组合物，ASCL1、CTIP2、DLX2的组合物，NGN2、CTIP2、DLX1的组合物或NGN2、CTIP2、DLX2的组合物。4.根据权利要求1所述的产生MSN的方法，其特征在于，在NPCs中表达外源的以下转录因子的方法包括：(a)提供细胞；(b)用表达载体将所述的转录因子转入(a)的细胞中，或通过蛋白转染将所述的转录因子转入(a)的细胞中；(c)培养(b)获得的细胞。5.根据权利要求4所述的产生MSN的方法，其特征在于，所述表达载体为病毒载体或非病毒载体，包括慢病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体，逆转录病毒载体或非病毒的质粒。6.一种MSN或其培养物，其特征在于，由权利要求1
‑
5任一项所述的产生MSN的方法获得。7.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐宇，任捷，吴俊娇，
申请(专利权)人：中南大学湘雅医院，
类型：发明
国别省市：