将干细胞分化为多巴胺能祖细胞的方法技术

本发明专利技术涉及将干细胞分化为腹侧中脑多巴胺能祖细胞和中脑多巴胺能神经元的方法及其组合物、试剂盒和用途。试剂盒和用途。试剂盒和用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】将干细胞分化为多巴胺能祖细胞的方法


[0001]本专利技术涉及将干细胞分化为腹侧中脑多巴胺能祖细胞和中脑多巴胺能神经元的方法及其组合物、试剂盒和用途。

技术介绍

[0002]神经退行性疾病诸如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病和亨廷顿氏病是导致神经元群体的进行性退化和/或死亡的不可治愈的并使人衰弱的病症。帕金森氏病(PD)与中脑一部分黑质致密部(SNpc)中多巴胺能(DA)神经元的进行性丧失有关，因此主要影响运动系统，导致动作迟缓、僵硬和静息性震颤。
[0003]使用细胞移植治疗神经退行性疾病始于20世纪80年代后期的临床试验，其中将来自胎儿大脑的多巴胺神经元祖细胞移植到患有帕金森氏病的个体中。这些试验表明，移植的细胞可以恢复丢失的多巴胺神经传递，并逆转运动缺陷。(A.&Lindvall,O.《帕金森氏病杂志(J.Parkinsons.Dis.)》7,S21
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S31(2017))。然而，胎儿组织的使用伴随着许多困难，诸如低可用性和高可变性以及许多伦理问题。继人类胚胎干细胞(hESCs)的衍生和2007年诱导多能干细胞(iPSCs)的发现之后，一种新的可扩展的人类多能干细胞(hPSCs)来源成为可能，这种来源有可能取代胎儿组织。
[0004]已经进行了广泛的发展以试图控制多能干细胞分化为中脑多巴胺能(mDA)神经元。Kirkeby,A.等人.《细胞报道(Cell Rep.)》1,703
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714(2012),Kriks,S.等人《自然(Nature)》480,547
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551(2011),和Marton,R.M.&Ioannidis,J.P.A.《干细胞转化医学(Stem Cells Transl.Med.)》8,366
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374(2019))。移植的hPSC衍生的制剂在动物PD模型中显示出功能功效，并且使用同种异体ESCs或自体iPSCs作为起始材料的临床试验已经开始或计划在不久的将来进行(Barker,R.A.,Parmar,M.,Studer,L.&Takahashi,J.《细胞干细胞(Cell Stem Cell)》21,569
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573(2017))。
[0005]尽管取得了这些进步，但仍然需要增强分化方案的稳健性，以便在使用新的hPSC线时提高一致性并最大限度地减少批次间的调整(Nolbrant,S.,Heuer,A.,Parmar,M.&Kirkeby,A.《自然实验手册(Nat.Protoc.)》12,1962
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1979(2017)。当考虑将患者特异性自体iPSC系或大量人类白细胞抗原(HLA)匹配的供体iPSC用于常规临床实践时，这一点尤其重要，因为从免疫学角度来看，免疫学匹配的iPSC优于同种异体ESC系(Wang,S.等人《细胞发现(Cell Discov.)》1,1
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11(2015)和Morizane,A.等人《自然通讯(Nat.Commun.)》8,1
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12(2017))。
[0006]在培养物中产生hPSC衍生的功能性人类神经元所需的延长时间提供了另一个挑战和成本负担，这阻碍了hPSC衍生的细胞在疾病建模或高通量药物开发中的常规应用(Qi,Y.等人《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》35,154
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163(2017))。就所需细胞类型的产率而言，用于产生mDA神经元的方案已逐步得到改进，但自2004年描述第一个基于hPSC的方案以来，在培养中获得成熟mDA神经元的时间基本上保持不变(Marton,R.M.&Ioannidis,J.P.A.(2019))。据报道，产生成熟的人类mDA神经元需要(通常需要)60天或更长时间，这些神经元
在培养中表现出所需的电生理特征(Niclis,J.C.等人《干细胞转化医学(Stem Cells Transl.Med.)》6,937
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948(2017)和Riessland,M.等人《细胞干细胞》25,514
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530.e8(2019))，它可以反映细胞达到功能状态所需的最短时间。然而，单细胞分析表明，相对于hPSC衍生的mDA神经元的体内对应物，其动力学更慢，且发育进程控制更不严格，(La Manno,G.等人《细胞(Cell)》167,566
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580.e19(2016))这增加了当前方法在分化时间方面尚未优化的可能性。
[0007]目前的mDA神经元方案利用WNT信号传导或WNT和FGF信号传导的定时激活，以通过模拟在中脑(MB)与后脑(HB)之间的边界处由峡部组织者产生的WNT1和FGF8的模式活性来指定中脑(MB)特征(Tao,Y.&Zhang,S.
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C.《细胞干细胞》19,573
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586(2016))。糖原合成酶激酶3β(GSK3β)抑制剂CHIR99021用于激活WNT通路，但CHIR99021对前后(AP)身份的规范是高度浓度敏感的(Lu,J；Zhong,等人S.《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》34,89
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95(2015))。这影响了一致性，并且需要非常小心地各个hPSC系进行滴定。此外，在大鼠PD模型中对大量基于CHIR99021的移植实验的评估揭示了显著的实验间变异性，并且移植物不良结果与移植前制剂中间脑基因的表达相关，这表明即使在CHIR99021的优化滴定后，细胞的区域规范也不精确(Kirkeby,A.等人《细胞干细胞》20,135
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148(2017))。
[0008]因此，需要替代方法来更有效地从干细胞衍生mDA神经元。

技术实现思路

[0009]在此背景下，专利技术人惊奇地发现了一种新的基于视黄酸(RA)的方法，用于以高产率稳健且快速地衍生人类mDA神经元。不同于将hPSC分化成多巴胺能神经元的其他方法，所述方法可能是冗长的、可变的，并且需要对单个hPSC系进行大量的方案调整(并且产生生物学上不相关的表型)，本专利技术允许干细胞被强有力地分化成腹侧中脑多巴胺能祖细胞，然后可将其用于移植，或者以增加的速度和前所未有的可扩展性进一步分化成成熟的真正的中脑多巴胺能神经元，同时自始至终保持适当的中脑表型。
[0010]一方面，本专利技术提供了一种将干细胞分化成腹侧中脑多巴胺能祖细胞，该方法包含使多个干细胞与有效量的至少一种视黄酸(RA)信号激活剂接触，以及在足以引起干细胞分化成包含腹侧中脑多巴胺能祖细胞的细胞群的条件下培养干细胞。
[0011]“干细胞”包括在胚胎和成人组织中发现的具有自我更新和分化成不同细胞类型能力的细胞。干细胞根据其产生多种细胞谱系的潜力分为全能、多能、多能力或单能。下面讨论本专利技术上下文中优选的干细胞。
[0012]本专利技术的方法的“多个干细胞”可以包含至少或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于将干细胞分化为腹侧中脑多巴胺能祖细胞的方法，所述方法包含使多个干细胞与有效量的至少一种视黄酸(RA)信号传导激活剂接触，并在足以引起所述干细胞分化为包含腹侧中脑多巴胺能祖细^胞的细胞群的条件下培养所述干细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种视黄酸(RA)信号传导激活剂有效地指定神经干细胞的腹侧中脑身份。3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述腹侧中脑多巴胺能祖细胞表达叉头盒蛋白A2(FOXA2)和LIM同源盒转录因子1α(LMX1A)。4.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述细胞群包含至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％的腹侧中脑多巴胺能祖细胞。5.根据任一前述权利要求所述的方法，其中在所述细胞群首次与所述至少一种视黄酸(RA)信号传导激活剂接触后至少7天后，诸如9
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16天，诸如约14天，所述细胞群包含至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％的腹侧中脑多巴胺能祖细胞。6.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述方法是体外方法。7.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述多个干细胞选自包含以下项的组：多能干细胞；多潜能干细胞；非胚胎干细胞，诸如成体干细胞(ASC)；并且其中所述多个干细胞来源于人，任选地，其中所述人是具有神经障碍症状的患者；啮齿动物；或灵长类动物。8.根据任一前述权利要求所述的方法，其中在足以引起所述干细胞分化成包含腹侧中脑多巴胺能祖细胞的细胞群的条件下培养所述干细胞包含使所述干细胞与至少一种豪猪(Hh)信号传导激活剂接触。9.根据任一前述权利要求所述的方法，其中至少一个豪猪(Hh)信号传导激活剂选自包含以下项的组：索尼克豪猪(SHH)、印度豪猪(IHH)、沙漠豪猪(DHH)、嘌呤胺、平滑激动剂(SAG)，诸如SAG 1.3(Hh
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1.3)、Hh
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1.2、Hh
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1.4、Hh
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1.5及其组合。10.根据任一前述权利要求所述的方法，其中在足以引起所述干细胞分化成包含腹侧中脑多巴胺能祖细胞的细胞群的条件下培养所述干细胞包含使所述干细胞与至少一种TGFβ/激活素
‑
节点信号传导抑制剂和至少一种骨形态发生蛋白(BMP)信号抑制剂接触。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述至少一种TGFβ/激活素
‑
节点信号传导抑制剂选自包含SB 431542和SB
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505124的组。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述至少一种BMP信号传导抑制剂选自包含DMH
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1；LDN
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193189；和Noggin的组。13.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述干细胞与所述视黄酸(RA)信号传导激活剂接触约1
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4天，任选地约1
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3天。14.根据权利要求13所述的方法，其中在接触所述多个干细胞约1
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4天，任选地约1
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3天后，所述至少一种视黄酸(RA)信号传导激活剂不以有效量存在。15.根据权利要求8至14中任一项所述的方法，其中所述干细胞在与所述至少一种视黄酸(RA)信号传导激活剂接触的同时与所述至少一个豪猪(Hh)信号传导激活剂、所述至少一种TGFβ/激活素
‑
节点信号传导抑制剂、和所述至少一种骨形态发生蛋白(BMP)信号传导抑制剂接触。16.根据权利要求8至14中任一项所述的方法，其中所述干细胞在与所述至少一种视黄酸(RA)信号传导激活剂接触之前，与所述至少一种豪猪(Hh)信号传导激活剂、所述至少一
种TGFβ/激活素
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节点信号传导抑制剂和所述至少一种骨形态发生蛋白(BMP)信号传导抑制剂接触。17.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述方法不包含使所述多个干细胞在所述至少一种视黄酸(RA)信号传导激活剂接触的同时与无翼(Wnt)信号传导激活剂接触。18.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述方法不包含使所述多个干细胞在与所述至少一种视黄酸(RA)信号传导激活剂接触的同时与成纤维细胞生长因子(FGF)家族信号传导激活剂接触。19.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述至少一种视黄酸(RA)信号传导激活剂选自包含以下项的组：视黄酸类似物；RARα激动剂；RARβ激动剂；RARγ激动剂；和RXR激动剂。20.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述至少一种视黄酸(RA)信号传导激活剂选自包含以下项的组：视黄酸、全反式视黄酸(ATRA)；AM 580；TTNPB；Ch 55；CD437；BMS 961；BMS 753；AM 80；CD 2314；AC 261066；AC 55649；CD 1530；阿达帕林；他扎罗汀酸；他扎罗汀；EC 19；EC23；或其功能类似物、异构体、代谢物或衍生物。21.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述至少一种视黄酸(RA)信号传导激活剂选自包含以下项的组：视黄酸；和全反式维甲酸(ATRA)，诸如9
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顺式RA和13
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顺式RA，以及他扎罗汀酸。22.根据任一前述权利要求所述的方法，其中至少一种视黄酸(RA)信号传导激活剂来自外生源。23.根据任一前述权利要求所述的方法，其中在足以引起所述干细胞分化以产生包含腹侧中脑多巴胺能祖细胞的细胞群的条件下培养所述干细胞是在二维和/或三维细胞培养物中进行。24.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述细胞群包含治疗有效量的腹侧中脑多巴胺能祖细胞。25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其还包含使包含腹侧中脑多巴胺能祖细胞的所述群体分化成中脑多巴胺能神经元。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述中脑多巴胺能神经元表达叉头盒蛋白A2(FOXA2)、LIM同源盒转录因子1α(LMX1A)、LIM同源盒转录因子1β(LMX1B)、正齿同源盒2(OTX2)、核受体相关1(NURR1)；成对样式的同源结构域3(PITX3)、GIRK2、囊泡单胺转运蛋白(VMAT2)、突触素和酪氨酸羟化酶(TH)中的一种或多种。27.根据权利要求25至26中任一项所述的方法，其中所述包含分化的中脑多巴胺能神经元的群体可在所述多个干细胞首次与所述至少一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：L，
申请(专利权)人：JZ细胞技术公司，
类型：发明
国别省市：