基于中药成分的胆碱能神经元分化方法及试剂盒技术

一种基于中药成分的胆碱能神经元分化方法及试剂盒，该方法包括：使用包含小分子制剂的第一培养基诱导人诱导多能干细胞分化至神经外胚层阶段细胞；使用包含Hedgehog通路激活剂的第二培养基诱导神经外胚层细胞分化至内侧神经节隆起细胞；使用包含中药成分的第三培养基诱导内侧神经节隆起细胞分化至成熟的胆碱能神经元，其中中药成分包括虎杖苷、芍药苷、红景天苷和二苯乙烯苷。本发明专利技术的该方法在切实可行的基础上具有高效、低成本等特点，从细胞形态和标志基因的表达上可以确定本发明专利技术定向、高效地分化至胆碱能神经元。从而为基于各种胆碱能神经元的研究提供更方便、快捷有效的细胞来源方案。来源方案。

【技术实现步骤摘要】
基于中药成分的胆碱能神经元分化方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于细胞生物学
，尤其涉及一种基于中药成分的胆碱能神经元分化方法及试剂盒。
技术背景
[0002]目前常见神经退行性疾病有阿尔兹海默病(AD)、路易体痴呆(DLB)、帕金森病(PD)等，这可严重影响患者的日常生活，增加家庭负担、社会成本，更者，目前针对其的药物治疗仅停留在“治标”层面。因此，以靶向对抗或抑制阿尔兹海默病发病机制的研究大量涌现，所涉研究领域也纵深加宽。在这个过程中，位于脑基底部的胆碱能神经元缺损成为了较为公认的病理机制之一，通过培养大量的胆碱能神经元进行神经替代治疗成为了新的考虑方向。间充质干细胞分化的神经元存在个体差异大、疗效不稳定等问题；以人胚胎干细胞为分化来源则存在伦理争议；而人诱导多能干细胞来源广泛、避免了伦理争议和免疫排斥问题的产生。
[0003]关于采用人诱导多能干细胞进行胆碱能分化的探索已有很多，大致的分化思路已形成：即按发生先后依次形成神经外胚(NE)
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内侧神经节隆起(MGE)
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基底前脑胆碱能神经元(BFCN)。虽看似完善，但具体到分化方案的每一处细节，如不同阶段的分化时间设置、培养体系的选用、关键作用物质的判断及添加，实验成本的控制、表征分析手段的选择等，不同的文章以不同侧重点进行研究，故一个成熟高效、相对统一标准化的分化方案还未形成。

技术实现思路

[0004]基于此，本专利技术的主要目的在于提供一种基于中药成分的胆碱能神经元分化方法及试剂盒，利用人诱导多能干细胞开发了一种高效、低成本的胆碱能神经元分化方法。
[0005]为了达到上述目的，作为本专利技术的一个方面，提供了一种高效的基于中药成分的胆碱能神经元分化方法。具体包括以下步骤：
[0006]使用包含小分子制剂的第一培养基诱导人诱导多能干细胞分化至神经外胚层细胞，其中小分子制剂包括TGF
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β通路抑制剂、BMP通路抑制剂和mTOR通路激活剂；
[0007]使用包含Hedgehog通路激活剂的第二培养基诱导神经外胚层细胞分化至内侧神经节隆起细胞；
[0008]使用包含中药成分的第三培养基诱导内侧神经节隆起细胞分化至成熟的胆碱能神经元，其中中药成分包括虎杖苷、芍药苷、红景天苷和二苯乙烯苷。
[0009]作为本专利技术的另一个方面，提供了一种基于中药成分的胆碱能神经元分化试剂盒，包括：
[0010]包含小分子制剂的第一培养基，用于诱导人诱导多能干细胞分化至神经外胚层细胞，其中小分子制剂包括TGF
‑
β通路抑制剂、BMP通路抑制剂和mTOR通路激活剂；
[0011]包含Hedgehog通路激活剂的第二培养基，用于诱导神经外胚层细胞分化至内侧神经节隆起细胞；以及
[0012]包含中药成分的第三培养基，用于诱导内侧神经节隆起细胞分化至成熟的胆碱能神经元，其中中药成分包括虎杖苷、芍药苷、红景天苷和二苯乙烯苷。
[0013]与现有技术相比，本专利技术的基于中药成分的胆碱能神经元分化方法及试剂盒至少具有以下有益效果的其中之一或其中一部分：
[0014]本专利技术以人诱导多能干细胞为起点，在不同发育阶段更换培养体系，通过促进或抑制不同的信号通路，并发挥神经保护作用，来促进向不同发育阶段分化，最终逐步诱导分化形成成熟的神经元。不仅避免了胚胎干细胞的伦理争议问题，并且，分化所得的胆碱神经元生理状态更符合真实的人体状况，更方便进行人类病理学、或生物学方面的研究。
[0015]本专利技术在最后的成熟阶段，添加了虎杖苷、芍药苷、红景天苷、二苯乙烯苷等传统中药植物提取成分，根据中药成分在不同信号通路中所起的作用进行组合研究，发现通过这些中药成分的协同作用可以来代替脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)，其价格低廉，但同样具有神经营养作用，促进胆碱能神经元的分化与成熟。
[0016]本专利技术最终得到的胆碱能神经元中可检测到乙酰胆碱转移酶(ChAT)、微管相关蛋白
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2(MAP2)、微管蛋白(βIII
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tubulin)、囊泡乙酰胆碱转运蛋白(VAChT)等相关酶、蛋白的高表达，以及CHAT、MAP2、TUBB3等胆碱能神经元特异性相关基因的高表达，结合细胞形态观察结果，确定得到了生长状态良好、形态结构符合、表达对应基因、蛋白的胆碱能神经元。
附图说明
[0017]图1A为本专利技术实施例中展示在神经外胚层阶段细胞形态的神经分化图；
[0018]图1B为本专利技术实施例中展示在内侧神经节隆起阶段细胞形态的神经分化图；
[0019]图1C为本专利技术实施例中展示在成熟阶段胆碱能细胞形态的神经分化图；
[0020]图2A为本专利技术实施例中经荧光定量PCR检测后得到的神经外胚层阶段的标志基因表达变化图；
[0021]图2B为本专利技术实施例中经荧光定量PCR检测后得到的内侧神经节隆起阶段的标志基因表达变化图；
[0022]图2C为本专利技术实施例中经荧光定量PCR检测后得到的胆碱能成熟阶段的标志基因表达变化图；
[0023]图3A为本专利技术实施例中在对照分化方案中以囊泡乙酰胆碱转运蛋白(VAChT)抗体对胆碱能神经元进行免疫荧光染色的结果；
[0024]图3B为本专利技术实施例中添加0.5μM白藜芦醇的分化方案中以囊泡乙酰胆碱转运蛋白(VAChT)抗体对胆碱能神经元进行免疫荧光染色的结果；
[0025]图3C为本专利技术实施例中添加0.5μM白藜芦醇和1μM丙戊酸的分化方案中以囊泡乙酰胆碱转运蛋白(VAChT)抗体对胆碱能神经元进行免疫荧光染色的结果；
[0026]图4为本专利技术实施例中使用不同混合浓度的四种中药成分胆碱能成熟阶段的标志基因表达变化图。
具体实施方式
[0027]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本专利技术作进一步的详细说明。
[0028]根据本专利技术的实施例，采用了人诱导多能干细胞来分化胆碱能神经元具有如下优点：(1)避免了使用胚胎干细胞会发生的伦理争议，同时可选择的重编程细胞范围较广，不局限。(2)免疫原性低，可以降低临床应用时的免疫排斥问题，扩大了应用的可能性。(3)其同时保有了胚胎干细胞的多向分化潜能、无限增殖的能力，可以较好地反映人体的真实情况。在使用人诱导多能干细胞的情况下，提出了详细的分化方案，方案中包括如使细胞的生长进入不同的阶段，确定怎样的添加物才能促进定向分化、提供细胞特定的营养必需，研究不同阶段的表征手法，从而得到生长状态良好、形态结构符合、表达对应基因、蛋白的胆碱能神经元。
[0029]具体而言，根据本专利技术的一些实施例，提供了一种基于中药成分的胆碱能神经元分化方法，具体包括以下步骤S1～S3。
[0030]在步骤S1，使用包含小分子制剂的第一培养基诱导人诱导多能干细胞分化至神经外胚层细胞，其中小分子制剂包括TGF
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...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于中药成分的胆碱能神经元分化方法，包括以下步骤：使用包含小分子制剂的第一培养基诱导人诱导多能干细胞分化至神经外胚层细胞，其中所述小分子制剂包括TGF
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β通路抑制剂、BMP通路抑制剂和mTOR通路激活剂；使用包含Hedgehog通路激活剂的第二培养基诱导所述神经外胚层细胞分化至内侧神经节隆起细胞；使用包含中药成分的第三培养基诱导所述内侧神经节隆起细胞分化至成熟的胆碱能神经元，其中所述中药成分包括虎杖苷、芍药苷、红景天苷和二苯乙烯苷。2.根据权利要求1所述的胆碱能神经元分化方法，其特征在于：所述TGF
‑
β通路抑制剂为SB431542，SB431542的浓度为5～10μM，优选为10μM；所述BMP通路抑制剂为LDN193189，LDN193189的浓度为5～500nM，优选为500nM；所述mTOR通路激活剂为丙戊酸，丙戊酸的浓度为0.05～100μM，优选为1μM。3.根据权利要求1所述的胆碱能神经元分化方法，其特征在于，所述Hedgehog通路激活剂为Purmorphamine，Purmorphamine的浓度为0.5～2μM，优选为1.5μM。4.根据权利要求1所述的胆碱能神经元分化方法，其特征在于，虎杖苷的浓度为0.01～10μM，优选为100nM；芍药苷的浓度为0.01～10μM，优选为100nM；红景天苷的浓度为0.01～10μM，优选为100nM；二苯乙烯苷的浓度为0.01～10μM，优选为100nM。5.根据权利要求1所述的胆碱能神经元分化方法，其特征在于，在所述第一培养基、所述第二培养基和所述第三培养基中还分别添加浓度为0.1～1μM的...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨珺涵，杨仁君，殷诺雅，费凡，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：