一种将干细胞诱导为中脑多巴胺能神经元前体细胞的诱导培养液及其应用、诱导方法技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种将干细胞诱导为中脑多巴胺能神经元前体细胞的诱导培养液及其应用、诱导方法，所述诱导培养液包括：嘌吗啡胺、非必需氨基酸、B27、腺苷

【技术实现步骤摘要】
一种将干细胞诱导为中脑多巴胺能神经元前体细胞的诱导培养液及其应用、诱导方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，特别是涉及一种将干细胞诱导为中脑多巴胺能神经元前体细胞的诱导培养液及其应用、诱导方法。

技术介绍

[0002]帕金森病(Parkinson's Disease，PD)是一种神经退行性病变，由中脑多巴胺能神经元的逐渐丧失引起。导致中脑多巴胺能神经元异常死亡的原因尚无明确定论，但是帕金森病是遗传和环境因素相互作用的结果。此外，目前还没有减缓多巴胺能神经元退化过程的有效治疗方法。但是帕金森综合症涉及的病变部位明确，因此干细胞治疗具有良好的靶向策略优势。干细胞治疗临床各种疾病特别是对再生能力有限的神经系统的退行性神经疾病拥有广阔的应用前景。
[0003]自20世纪80年代末首次开展利用胎儿中脑组织替代疾病中丢失的多巴胺能神经元的临床试验以来，全世界已有数百名患者接受了胎儿组织移植，其中一些患者已显示出长期的移植存活，临床效果良好，几十年来与多巴胺的生理释放相结合。自人类胚胎干细胞(hESCs)分化移植应用于治疗帕金森综合征之后，细胞移植开始成为一种新的治疗思路。随后其他不同来源的干细胞，例如诱导多能干细胞、间充质干细胞等也成为帕金森综合征治疗的备选种子细胞，而其中脂肪间充质干细胞对于帕金森氏症的治疗作用值得深一步研究。
[0004]在各类干细胞中，脂肪间充质干细胞(Adipose
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derived Stem cells，ADSCs)具有低免疫源性和抑制免疫作用，具有作为种子细胞的优势，但其在帕金森综合征治疗中的应用尚待探索。相较于其他种类的干细胞，其中胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ESCs)增殖、分化能力出众，但ESCs涉及到伦理、免疫排斥、致瘤性等问题；诱导性多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells，iPSCs)克服了伦理问题，避开了免疫排斥，在疾病模型和新药筛选方面表现出了强大的功能，但其致瘤性和生物安全性依然阻碍临床应用。ADSCs因为取材方便、对病人危害小、体外分离扩增容易且培养过程中老化率低、免疫原性低且具免疫正调节功能、无致瘤性等优点成为非常有希望的临床移植用种子细胞。当前已有的研究证明，ADSCs具有多向分化潜能，能够向包括神经细胞、软骨细胞、成骨细胞、胰岛素分泌细胞、心肌细胞等功能细胞分化，这些研究均证明了ADSCs在治疗退行性或损伤性疾病方面的应用价值和优势。
[0005]在现有技术中，中国专利CN104379732B提供了由人多能干细胞衍生神经干细胞和多巴胺能神经元，基于化学上定义的由人多能干细胞(hPSC)生成神经干细胞(NSC)和多巴胺能(DA)神经元的方法。该专利技术用检测点激酶1(CK1)抑制剂和骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂处理人多能干细胞(hPSC)产生神经干细胞，然后多巴胺能神经元相关诱导化合物诱导，可选诱导化合物为高奎宁酸、L
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半胱亚磺酸、犬尿喹啉酸、(R)
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(+)
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HA
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966、间氯苯基双胍盐酸盐、钙蛋白酶抑制剂、Dimaprit二盐酸盐、8
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羟基
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DPAT
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氢溴酸盐等。
[0006]中国专利CN103865956B提供一种利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，包括重组慢病毒载体构建(目的基因TH和Brn4的慢病毒载体)；神经干细胞的分离、培养及鉴定；重组病毒转染NSCs；重组慢病毒转染NSCs的鉴定。分化后产生高比例的TH阳性多巴胺能神经元；Brn4能促进神经营养因子的高表达，且具有抑制细胞凋亡的功能。
[0007]中国专利CN104789531B提供一种将脐带间充质干细胞诱导分化成多巴胺能神经元的方法，该方法采用预诱导和诱导二步结合法。第一种诱导培养基：添加5
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氮胞苷和三酰叠氮脂蛋白，第二种诱导培养基：添加碱性成纤维细胞生长因子和Noggin蛋白，第三种诱导培养基：添加碱性成纤维细胞生长因子、维甲酸、成纤维细胞生长因子8和Wnt3a蛋白，第四种诱导培养基：添加骨成形蛋白4、Shh蛋白、维甲酸、神经生长因子和脑源性神经营养因子。
[0008]中国专利CN104031882B提供一种人神经干细胞体外定向诱导分化为多巴胺能神经元的方法，包括：步骤1、人神经干细胞的贴壁培养：用无血清培养基将人神经干细胞按照5
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104/mL的浓度制成细胞悬液，接种至层粘连蛋白(Laminin，LN，)包被的培养器皿中，35℃培养箱中静置培养24
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48小时；步骤2：多巴胺能神经元前体细胞的诱导：换用多巴胺能神经元前体细胞诱导液，此诱导液由无血清培养基添加细胞因子SHH、FGF8b、CHIR99021组成，35℃培养箱中静置培养7
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10天，每3天换液；步骤3：多巴胺能神经元细胞的定向诱导：换用多巴胺能神经元细胞定向诱导液，此诱导液由神经细胞培养基Neurobasal Medium添加B27、BDNF、GDNF、TGFβ3、ascorbic acid、cAMP、forskolin组成；35℃培养箱中静置培养14
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20天，每3天换液；收获细胞后即得到多巴胺能神经元。上述步骤1、2中细胞的无血清培养基的配方可以为DMEM/F12、B27(1∶50)、N2(1∶50)、bFGF(20ng/mL，)与EGF(20ng/mL)。
[0009]中国专利CN101029302B提供一种用于治疗帕金森病的多巴胺能神经元和具有增殖能力的前体细胞，胚状体(EB)在纤连细胞包被的平板上铺板。胚状体粘着到平板上，并且细胞开始迁移到塑料上，形成单细胞层。EB通过在1mg/mL的胶原酶中培养(37℃，5
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20分钟)传代32次时从H7细胞系的融合hES细胞产生，刮削培养皿，并将细胞放入非
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粘着培养平板中获得的EB培养于含有FBS和10μM的视黄酸的培养基中的悬浮液中。4天后，收集聚集体并使之沉淀于离心管中。然后吸出上清液，并且聚集体在增殖培养基中(添加1：100N2的DMEM/F12，1：50的B27，10ng/mL的EGF，10ng/mL的bFGF，1ng/mL的PDGF
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AA，和1ng/mL的IGF的聚L
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赖氨酸和纤连蛋白包被的平板上铺板。使EB附着并增殖3天；然后通过胰蛋白酶消化约1min收集并以1.5
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105个细胞/孔的密度铺板于增殖培养基中的聚L
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赖氨酸和层粘连蛋白包被的4
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孔分室玻片上1天。然后将培养基改为Neural Basal培养基，该培养基添加了B27，以及下面的生长混合物之一：10ng/mL bFGF，10ng/mL BDNF，和10ng/mL NT
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3，5000ng/mL的SHH，和100ng/mL的F本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种将干细胞诱导为中脑多巴胺能神经元前体细胞的诱导培养液，其特征在于，所述诱导培养液包括：2.根据权利要求1所述的一种将干细胞诱导为中脑多巴胺能神经元前体细胞的诱导培养液，其特征在于：所述生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子和成纤维细胞生长因子8b；所述神经营养因子包括神经生长因子和神经营养因子3；所述诱导培养液的基础培养基为神经元基础培养基；所述诱导培养液包括：3.根据权利要求2所述的一种将干细胞诱导为中脑多巴胺能神经元前体细胞的诱导培养液，其特征在于：所述诱导培养液包括：
4.一种将干细胞诱导为中脑多巴胺能神经元前体细胞的诱导培养液，其特征在于，所述诱导培养液包括：5.根据权利要求4所述的一种将干细胞诱导为中脑多巴胺能神经元前体细胞的诱导培养液，其特征在于：所述生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子和成纤维细胞生长因子8b；所述神经营养因子包括神经生长因子和神经营养因子3；所述诱导培养液的基础培养基为神经元基础培养基；所述诱导培养液包括：
6.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：高山峨，郭璇璇，钟春龙，
申请(专利权)人：上海市东方医院同济大学附属东方医院，
类型：发明
国别省市：