本发明专利技术公开了一种大鼠原代足细胞系和原代壁层上皮细胞系的构建方法及其应用，属于细胞技术领域。该构建方法包括将经PBS溶液肾脏局部灌注获得的肾皮质经酶混合溶液孵育消化，而后分别过筛获得肾小球，将其移至37℃下恒温培养的步骤。本发明专利技术还提供一种根据上述的构建方法构建得到的大鼠原代足细胞系和原代壁层上皮细胞系，及肾小球固有细胞的分离培养、分子调控机制及足细胞和壁层上皮细胞相互作用模型中的应用。本发明专利技术的构建方法重复性强，操作步骤简单，原代足细胞和壁层上皮细胞生长状态良好，生理状态稳定。本发明专利技术所提供的大鼠原代足细胞和壁层上皮细胞细胞系为后续肾小球固有细胞特定功能及细胞间相互作用的科学研究奠定理论基础和科技支撑。究奠定理论基础和科技支撑。究奠定理论基础和科技支撑。
【技术实现步骤摘要】
一种大鼠原代足细胞和原代壁层上皮细胞细胞系的构建方法及其应用
[0001]本专利技术涉及细胞
，特别是涉及一种大鼠原代足细胞和原代壁层上皮细胞细胞系的构建方法及其应用。
技术介绍
[0002]足细胞(podocyte)是一种终末分化的肾脏脏层内皮细胞，具有初级足突与次级足突，相邻足细胞足突由裂孔隔膜相连，与带窗孔的内皮细胞和肾小球基底膜共同构成肾小球滤过屏障。在基于营养代谢敏感的哺乳动物中，足细胞常用做体外研究肾小球滤过屏障功能的体外研究模型。然而，目前对足细胞的研究愈发深入，但在营养代谢敏感的大鼠研究中未见有对应足细胞的体外培养模型。
[0003]壁层上皮细胞(parietal epithelial cells)为保有干细胞标志蛋白的肾脏壁层上皮细胞，与足细胞一同起源于后肾间充质干细胞，解剖位置在肾小球鲍曼囊壁上，与足细胞毗邻，且从尿极至血管极壁层上皮细胞逐渐丧失干细胞特征而表达足细胞标识蛋白，壁层上皮细胞可能为足细胞增殖的来源之一。在哺乳动物模型中，壁层上皮细胞常用做体外研究鲍曼囊在肾小球中功能及和损伤足细胞相互作用的体外研究模型。但目前对壁层上皮细胞的研究相对较少，并且缺乏壁层上皮细胞的体外培养模型。
[0004]本专利技术将以肾脏发育临近成熟的雄性大鼠(Sprague
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Dawley)肾脏组织为研究对象，建立大鼠原代足细胞和原代壁层上皮细胞细胞系培养体系并对分离的细胞进行鉴定，为今后大鼠足细胞和壁层上皮细胞分子调控机制及同一组织内相邻细胞间相互作用的细胞模型提供参考资料。
[0005]专利技术目的
[0006]本专利技术的目的是提供一种大鼠原代足细胞和原代壁层上皮细胞细胞系的构建方法及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本专利技术所提供的大鼠原代足细胞和原代壁层上皮细胞细胞系为后续大鼠肾小球固有细胞特定功能及细胞间相互作用的科学研究奠定理论基础和科技支撑，且所提供的细胞系能够用于研究疾病模型下相邻细胞损伤启动另一干细胞增殖分化分子机制。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0008]本专利技术提供了一种大鼠原代足细胞和原代壁层上皮细胞细胞系的构建方法，包括以下步骤：
[0009](1)超净工作台内固定麻醉大鼠四肢，肾脏局部灌注
[0010](2)摘取双侧肾脏，剥去肾包膜后尽量修剪肾门区域，肾皮质在酶混合溶液中恒温培养箱孵育，过筛获得去囊肾小球悬液
[0011](3)肾皮质过筛获得具囊肾小球悬液，将所有获得的肾小球悬液洗涤3
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4次
[0012](4)肾小球悬液接种于胶原包被的细胞板中37℃培养箱培养分别得到原代足细胞和原代壁层上皮细胞
[0013](5)胰酶收集培养获得的原代足细胞和原代壁层上皮细胞，过筛去除肾小球，重新接种两种原代细胞，待细胞贴壁率达80％时，每4
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5天传代一次
[0014](6)采用免疫荧光染色法鉴定。
[0015]进一步地，在步骤(1)中，所述肾脏灌注的溶液为D
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PBS缓冲液。
[0016]进一步地，在步骤(2)中，所述酶混合溶液为提前热孵的胶原酶A+脱氧核糖核酸酶I混合溶液。进一步地，在步骤(2)中，所述过筛网目为150目及200目
[0017]进一步地，在步骤(3)中，所述过筛网目为80目及100目
[0018]进一步地，在步骤(4)中，所述两种原代细胞需培养7
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9天
[0019]进一步地，在步骤(5)中，所述胰酶为1/2EDTA胰酶溶液
[0020]进一步地，在步骤(5)中，所述过筛去除肾小球为40μm孔径网筛
[0021]进一步地，在步骤(6)中，所述的免疫荧光染色为足细胞特异性足突骨架蛋白标记基因Synaptopodin作为标记物在原代足细胞中进行免疫荧光检测；所述的免疫荧光染色还包括壁层上皮细胞特异性核转录因子标记基因PAX2和特异性胞间连接蛋白标记基因Claudin
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1作为标记物在原代壁层上皮细胞中进行免疫荧光检测。
[0022]本专利技术还提供一种根据上述的构建方法构建得到的大鼠原代足细胞系和原代壁层上皮细胞系。
[0023]本专利技术还提供上述原代足细胞系和原代壁层上皮细胞系在两种肾小球固有细胞的分离培养、足细胞和壁层上皮细胞分子调控机制，建立足细胞和壁层上皮细胞相互作用模型中的应用。本专利技术公开了以下技术效果：
[0024]本专利技术在无菌条件下获取大鼠肾皮质组织，并将其立即置于胶原酶A+脱氧核糖核酸酶I混合溶液中恒温孵育；研磨过不同网目网筛后用D
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HBSS溶液洗涤肾小球，进一步离心提纯；使用含胎牛血清、双抗(青霉素
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链霉素)的DMEM/F
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12完全培养基重悬沉淀，可获得去囊肾小球和具囊肾小球，经上述完全培养基培养7天后获得原代足细胞和原代壁层上皮细胞。本专利技术提供的大鼠原代足细胞和原代壁层上皮细胞的分离和原代培养方法，所获得的大鼠原代足细胞和原代壁层上皮细胞生长状态稳定，可连续传代，且通过传代能够批量获得大鼠原代足细胞和原代壁层上皮细胞。
[0025]本专利技术的大鼠原代足细胞和原代壁层上皮细胞构建方法操作简便，可重复性强，可为其他哺乳动物足细胞和壁层上皮细胞的分离培养提供参考。
[0026]本专利技术获得的原代足细胞系和原代壁层上皮细胞系可为两种肾小球固有细胞的分离培养、足细胞和壁层上皮细胞分子调控机制及足细胞和壁层上皮细胞相互作用模型中的应用提供参考材料。
[0027]为了更清楚说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要实用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
附图说明
[0028]图1为原代足细胞和原代壁层上皮细胞不同贴壁时长的生长状态，其中，a,c,e为足细胞形态图，b,d,f为壁层上皮细胞形态图
[0029]图2为原代足细胞Synaptopodin免疫荧光鉴定结果，其中，红色荧光为荧光成像细胞图，蓝色荧光为DAPI染色后的细胞核；综合为叠加图；
[0030]图3为原代壁层上皮细胞PAX2和Claudin
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1免疫荧光鉴定结果，其中，红色为荧光成像细胞图，蓝色荧光为DAPI染色后的细胞核；综合为叠加图；
[0031]图4为原代足细胞和原代壁层上皮细胞光镜下的形态图，a为去囊肾小球所得原代足细胞的传代细胞形态图；b为具囊肾小球所得原代壁层上皮细胞的传代细胞形态图；
[0032]图5为原代足细胞光镜下的形态图，a为提前预热的胶原酶A+脱氧核糖核酸酶I混合溶液中恒温孵育分离的去囊肾小球所得原代足细胞的细胞形态图；b为未提前热孵的胶原酶A+脱氧核糖核酸酶I混合溶液中室温孵育分钟分离的去囊肾小球所得原代足细胞的细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种大鼠原代足细胞和原代壁层上皮细胞细胞系的构建方法及其应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)超净工作台内固定麻醉大鼠四肢，肾脏局部灌注(2)摘取双侧肾脏，剥去肾包膜后尽量修剪肾门区域，肾皮质在酶混合溶液中恒温培养箱孵育，过筛获得去囊肾小球悬液(3)肾皮质过筛获得具囊肾小球悬液，将所有获得的肾小球悬液洗涤(4)肾小球悬液接种于胶原包被的细胞板中37℃培养箱培养分别得到原代足细胞和原代壁层上皮细胞(5)胰酶收集培养获得的原代足细胞和原代壁层上皮细胞，过筛去除肾小球，重新接种两种原代细胞，待细胞贴壁率达80％时，每4
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5天传代一次(6)采用免疫荧光染色法鉴定。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述肾脏灌注的溶液为D
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PBS缓冲液。3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述酶混合溶液为提前热孵的胶原酶A+脱氧核糖核酸酶I混合溶液。4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述过筛网目为150目及200目。5.如权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：张冬梅，孔令东，王婉如，杨颖芝，蒋巧云，邢钰，周子昂，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：
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