RNA沉淀液在检测mRNA加帽效率中的用途制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别是涉及RNA沉淀液在检测mRNA加帽效率中的用途。本发明专利技术的RNA沉淀液包含LiCl和乙醇。本发明专利技术的RNA沉淀液用于检测mRNA加帽效率。本发明专利技术检测mRNA加帽效率时，不需要将酶切产物单独纯化出来；并且相较于常规检测方法，更快捷方便，可同时进行批量样品的处理，并且对于酶切探针要求低，不需要进行生物素修饰，不仅降低了合成成本，合成周期也显著缩短。样品在进行酶切处理后可直接补加沉淀液，沉淀洗脱后用无酶水复溶即可上机检测，操作简单、回收率高。回收率高。回收率高。

【技术实现步骤摘要】
RNA沉淀液在检测mRNA加帽效率中的用途


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及RNA沉淀液在检测mRNA加帽效率中的用途。

技术介绍

[0002]mRNA疫苗由于其研发周期短，且免疫效果明显等优势成为了新型疫苗热点。这种在疫苗中激发免疫反应的mRNA是通过体外模拟内源性mRNA分子而合成，有5个重要元件，从5
ʹ
端到3
ʹ
端分别是：5
ʹ
端帽状结构，5
ʹ
端非翻译区，一个编码抗原的开放阅读框，3
ʹ
端非翻译区和3
ʹ
端poly (A) 尾状结构。
[0003]5'端帽状结构像真核生物的mRNA一样，含一个7
‑
甲基鸟苷，通过三磷酸桥接到mRNA的5'端。在哺乳动物中，从5 '端开始的第一个或第二个核苷酸在核糖的2 '羟基上被甲基化，这阻止了细胞质内的细胞器将其识别为病毒RNA，从而避免了相应免疫反应的发生。
[0004]帽子结构对稳定mRNA及其翻译具有重要意义，它将5
’
端封闭起来，可免遭核酸外切酶水解；还可作为蛋白合成系统的辨认信号，被一种帽子结合蛋白（eIF
‑
4E）识别并结合，促使mRNA与核糖体小亚基结合，进而启动翻译过程。因此，在体外合成mRNA过程中，检测加帽效率成为监测mRNA质量的一个必不可少的指标。
[0005]目前，能够精确定量检测加帽效率的方法主要有飞行质谱法（HPLC
‑
MS）、反向液相质谱法（RP
‑
HPLC） 和毛细管电泳法（CE），后两种由于其无法分离加帽过程中的过程副产物GCap、Cap0和Cap1结果，因此检测结果会与真实值存在偏差，具有局限性；HPLC
‑
MS是目前最常见的检测方法。
[0006]在mRNA加帽效率检测过程中，由于mRNA全长过长，需先设计特殊裂解探针配合RNase H，将样品酶切成带有帽结构的小片段核苷酸（目标物）与长片段RNA分子，纯化回收后利用HPLC
‑
MS进行检测。目前主流的纯化方式为磁珠法，即利用携带生物素标记的裂解探针结合mRNA，再通过链霉亲和素磁珠吸附生物素标记探针
‑
mRNA片段，从而达成将带有帽结构的小片段目标物分离出来的目的。该方法能够分离带有帽结构的小片段核苷酸（目标物）与长片段RNA分子，但其纯化时间长，磁珠和带有标记的裂解探针价格昂贵，操作复杂不适宜大批量使用。

技术实现思路

[0007]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供RNA沉淀液在检测mRNA加帽效率中的用途，用于解决现有技术中的问题。
[0008]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供RNA沉淀液在检测mRNA加帽效率中的用途，所述RNA沉淀液包含LiCl和乙醇。
[0009]优选地，所述RNA沉淀液中LiCl的工作浓度为0.01
‑
10M。
[0010]本专利技术还提供一种检测mRNA加帽效率的方法，所述方法包括如下步骤：1）将待测mRNA、和mRNA 5
’
UTR互补的探针混合；
2）将步骤1）中混合物与RNase反应液混合，将mRNA的5
’
端分离；3）将步骤2）中混合物与前述RNA沉淀液混合，沉淀mRNA；4）将步骤3）中沉淀物清洗、干燥、溶解后检测mRNA加帽效率。
[0011]如上所述，本专利技术的RNA沉淀液在检测mRNA加帽效率中的用途，具有以下有益效果：1）本专利技术在检测过程中，仅需去除可能干扰HPLC
‑
MS系统的蛋白与盐，而不需要将酶切产物单独纯化出来；2）本专利技术中提供的检测方法相较于常规检测方法，更快捷方便，可同时进行批量样品的处理，并且对于酶切探针要求低，不需要进行生物素修饰，不仅降低了合成成本，合成周期也显著缩短。样品在进行酶切处理后可直接补加沉淀液，沉淀洗脱后用无酶水复溶即可上机检测，操作简单、回收率高。
附图说明
[0012]图1显示为本专利技术的不同底物用量的酶切回收中100pmol的检测结果。
[0013]图2显示为本专利技术的不同底物用量的酶切回收中50pmol的检测结果。
[0014]图3显示为本专利技术的不同底物用量的酶切回收中25pmol的检测结果。
[0015]图4显示为本专利技术的对比例生物素磁珠法的检测结果。
[0016]图5显示为本专利技术的RNA沉淀液法的检测结果。
[0017]图6显示为本专利技术的不同工作浓度LiCl沉淀液纯化短片段样品的回收率结果。
[0018]图7显示为本专利技术的不同工作浓度LiCl的平均回收率柱状图。
[0019]图8显示为本专利技术的不同组分的RNA沉淀液纯化短片段样品的回收率结果。
[0020]图9显示为本专利技术的不同组分的RNA沉淀液平均回收率柱状图。
[0021]图10显示为本专利技术的RNA酶切反应体系。
[0022]图11显示为本专利技术的LiCl
‑
无水乙醇沉淀液配置体系。
[0023]图12显示为本专利技术的同一样品不同浓度的mRNA加帽效率检测结果。
具体实施方式
[0024]本专利技术提供RNA沉淀液在检测mRNA加帽效率中的用途，所述RNA沉淀液包含LiCl和乙醇。
[0025]在一些具体实施方式中，所述RNA沉淀液中LiCl的工作浓度为0.01
‑
10M。更具体地，所述LiCl的工作浓度为0.01
‑
0.03 M、0.03
‑
0.05 M、0.05
‑
0.06125 M、0.06125
‑
0.1 M、0.1
‑
0.125 M、0.125
‑
0.25 M、0.25
‑
0.5 M、0.5
‑
1 M、1
‑
2 M、2
‑
4 M、4
‑
6 M、6
‑
8 M、8
‑
9 M或9
‑
10M。优选地，所述RNA沉淀液中LiCl的工作浓度为0.06125
‑
0.25 M。
[0026]在一些具体实施方式中，所述RNA沉淀液中LiCl为LiCl
‑
乙醇溶液或纯LiCl。
[0027]在一些具体实施方式中，所述RNA沉淀液中乙醇为溶剂。
[0028]在一些具体实施方式中，所述RNA沉淀液还包含醋酸钠、醋酸铵或异丙醇中的一种或多种。
[0029]在一些具体实施方式中，所述RNA沉淀液用于沉淀5
’
端被分离的mRNA；所述5
’
端被分离的mRNA通过RNase与待测mRNA
‑
探针复合物反应获得。所述待测mRNA
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.RNA沉淀液在检测mRNA加帽效率中的用途，所述RNA沉淀液由LiCl和乙醇组成；所述RNA沉淀液中LiCl的工作浓度为0.06125
‑
0.25 M；所述检测mRNA加帽效率的方法为采用高效液相色谱联用飞行质谱法；所述RNA沉淀液用于沉淀5
’
端被分离的mRNA；所述5
’
端被分离的mRNA通过RNase与待测mRNA
‑
探针复合物反应获得。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述RNA沉淀液中乙醇为溶剂。3.一种检测mRNA加帽效率的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1）将待测mRNA、和mRNA 5
’
UTR互补的探针混合；2）将步骤1）中混合物与RNase反应液混合，将mRNA的5
’
端分离；3）将步骤2）中混合物与权利要求1
‑
2任一所述的用途中RNA沉淀液混合，沉淀mRNA；4）将步骤3）中沉淀物清洗、干燥、溶解后检测mRNA加帽效率；所述检测mRNA加帽效率的方法为采用高效液...

【专利技术属性】
技术研发人员：王子洋，李亚丽，周玲云，李永娟，
申请(专利权)人：苏州近岸蛋白质科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：