一种检测mRNA2制造技术

本发明专利技术提供了一种检测mRNA 2'

【技术实现步骤摘要】
一种检测mRNA 2
′‑
O
‑
甲基转移酶活性的方法


[0001]本专利技术属于生物工程领域，具体地，是关于一种检测mRNA 2'
‑
O
‑
甲基转移酶活性的方法。

技术介绍

[0002]目前检测2'
‑
O
‑
甲基转移酶活性的主要方法是底物放射性标记，使用[甲基
‑ꢀ3H]‑
SAM表征所有利用SAM（S
‑
腺苷甲硫氨酸）的甲基转移酶家族。反应在[甲基
‑ꢀ3H]‑
SAM和短GpppX
‑
RNA 之间进行，对转移的[ 3
H]CH3进行定量分析然后使用TLC产物分离和放射性计数进行分组。通过使用放射性标记的RNA/核苷酸，可以观察核苷酸底物结构中出现的变化。该方法安全性低，存在放射性污染，且步骤繁琐，实验环境要求高，成本高。
[0003]因此，本领域需要开发一种安全高、无放射性污染、步骤简单、实验环境要求低、成本低的检测mRNA 2'
‑
O
‑
甲基转移酶活性的方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种检测mRNA 2'
‑
O
‑
甲基转移酶活性的方法。
[0005] 在本专利技术的第一方面，提供了一种体外检测mRNA 2'
‑
O
‑
甲基转移酶活性的方法，包括以下步骤：（S1）提供5
’
末端为5
’‑
三磷酸的单链RNA分子；（S2）对（S1）中的RNA分子分别进行以下测试反应，所述测试反应包括在阴性测试体系、第一测试体系、第二测试体系中反应，反应时间为t，其中：阴性测试体系中，不包含酶；第一测试体系中，包含Cap0加帽酶；第二测试体系中，包含Cap0加帽酶和mRNA 2'
‑
O
‑
甲基转移酶；（S3）检测（S2）中，阴性测试体系、第一测试体系和第二测试体系中的SAH的形成情况，与标准曲线或标准值对比，得到SAH的定量结果：其中，阴性测试体系中SAH生成量为A0；第一测试体系中SAH生成量为A1；第二测试体系中SAH生成量为A2；其中，
△
质
=A1
‑
A0；
△1=A2
‑
A1；如果
△
质
低于预定值，则认为测试失败；如果
△1/
△
质
＞1，则认为待检测的2'
‑
O
‑
甲基转移酶有酶活性，所述的酶活性为
△1/t；如果
△1/
△
质
=1，则认为待检测的2'
‑
O
‑
甲基转移酶无活性。
[0006]其中，
“△
质”表示质控值，即第一测试体系与阴性测试体系中SAH生成量的差值，
“△
1”表示mRNA 2'
‑
O
‑
甲基转移酶的SAH生成量，即第二测试体系与第一测试体系中SAH生成量的差值。
[0007]在另一优选例中，所述预定值为0。
[0008]在另一优选例中，所述单链RNA分子的长度为500
‑
2000 nt，较佳地为1000 nt。
[0009]另一优选例中，在阴性测试体系、第一测试体系或第二测试体系中，所述RNA的终浓度各自独立地为150μg/500μl
‑
350μg/500μl，较佳地为250μg/500μl。
[0010]在另一优选例中，在阴性测试体系、第一测试体系或第二测试体系中，各自独立地包含SAM、GTP、10
×
加帽反应缓冲液和RNase抑制剂。
[0011]在另一优选例中，所述10
×
加帽反应缓冲液的终浓度为1X加帽反应缓冲液。
[0012]在另一优选例中，所述SAM的终浓度为0.25 mM
‑
0.75 mM，较佳地为0.5 mM。
[0013]在另一优选例中，所述GTP的终浓度为0.5 mM
‑
2 mM，较佳地为1 mM。
[0014]在另一优选例中，所述RNase抑制剂的终浓度为0.5 U/μl
‑
2 U/μl，较佳地为1 U/μl。
[0015]在另一优选例中，所述Cap0加帽酶为牛痘病毒加帽酶。
[0016]在另一优选例中，第一测试体系中，所述Cap0加帽酶的终浓度为0.3 U/μl
‑
0.8 U/μl，较佳地为0.4 U/μl。
[0017]在另一优选例中，第二测试体系中，所述Cap0加帽酶的终浓度为0.3 U/μl
‑
0.8 U/μl，较佳地为0.4 U/μl。
[0018]在另一优选例中，第二测试体系中，所述mRNA 2'
‑
O
‑
甲基转移酶的终浓度为2 U/μl
‑
8 U/μl，较佳地为4 U/μl。
[0019]在另一优选例中，所述反应时间t为0.8
‑
1.4h；较佳地，反应时间t为1h。
[0020]在另一优选例中，所述测试反应在35
‑
38℃下进行；较佳地，在37℃下进行。
[0021]在另一优选例中，第一测试体系中，反应条件为：37℃下，反应时间t为0.8
‑
1.4h；较佳地，37℃下，反应时间t为1h。
[0022]在另一优选例中，第二测试体系中，反应条件为：37℃下，反应时间t为0.8
‑
1.4h；较佳地，37℃下，反应时间t为1h。
[0023]在另一优选例中，（S1）中，所述5
’
末端为5
’‑
三磷酸的单链RNA分子为DNA体外转录获得的mRNA。
[0024]在另一优选例中，（S1）中，还包括：（S1.1）提供一DNA；（S1.2）体外转录（S1）中的DNA，获得由所述DNA转录的mRNA。
[0025]在另一优选例中，（S1.2）中，还包括：将转录纯化后的mRNA置于PCR仪中65℃ 5min，反应结束立刻置于冰上5min。
[0026]在另一优选例中，（S1.1）中，所述目的基因为eGFP基因。
[0027]在另一优选例中，（S1.2）中，使用T7 RNA聚合酶转录DNA，获得由所述DNA转录的mRNA。
[0028]在另一优选例中，（S3）中，所述检测为HPLC检测。
[0029]在另一优选例中，（S3）中，包括：（S3.1）设置适合SAH分离的色谱条件；（S3.2）绘制SAH的标准曲线：将SAH标准品梯度稀释为不同摩尔浓度的SAH标准溶液，在（S3.1）的色谱条件下，根据液相色本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种体外检测mRNA 2'
‑
O
‑
甲基转移酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：（S1）提供5
’
末端为5
’‑
三磷酸的单链RNA分子；（S2）对（S1）中的RNA分子分别进行以下测试反应，所述测试反应包括在阴性测试体系、第一测试体系、第二测试体系中反应，反应时间为t，其中：阴性测试体系中，不包含酶；第一测试体系中，包含Cap0加帽酶；第二测试体系中，包含Cap0加帽酶和mRNA 2'
‑
O
‑
甲基转移酶；（S3）检测（S2）中，阴性测试体系、第一测试体系和第二测试体系中的SAH的形成情况，与标准曲线或标准值对比，得到SAH的定量结果：其中，阴性测试体系中SAH生成量为A0；第一测试体系中SAH生成量为A1；第二测试体系中SAH生成量为A2；其中，
△
质
=A1
‑
A0；
△1=A2
‑
A1；如果
△
质
低于预定值，则认为测试失败；如果
△1/
△
质
＞1，则认为待检测的2'
‑
O
‑
甲基转移酶有酶活性，所述的酶活性为
△1/t；如果
△1/
△
质
=1，则认为待检测的2'
‑
O
‑
甲基转移酶无活性。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单链RNA分子的长度为500
‑
2000 nt。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Cap0加帽酶为牛痘病毒加帽酶。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第一测试体系中，所述Cap0加帽酶的终浓度为0.3 U/μl
‑
0.8 U/μl。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第二测试体系中，所述Cap0加帽酶的终浓度为0.3 U/μl
‑
0.8 U/μl。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑紫君，吴亚会，郑实，朱化星，赵曼曼，张清仪，
申请(专利权)人：苏州近岸蛋白质科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：