一种高效的tRNA甲基化酶抑制剂筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种高效的tRNA甲基化酶抑制剂筛选方法，包括步骤构建体外反应筛选体系，将待筛选小分子化合物与体外反应筛选体系混合，得到反应最终物，对反应最终物进行Dot Blot分析，获得体外反应筛选体系的Dot Blot扫描图，对Dot Blot扫描图中小分子化合物样本进行分类，分析分类后的小分子化合物样本，获得缺陷样本，修复缺陷样本，进行小分子化合物筛选。本发明专利技术实现了自动检测缺陷样本和修复缺陷样本斑点，使得后续识别过程更准确。使得后续识别过程更准确。使得后续识别过程更准确。

【技术实现步骤摘要】
一种高效的tRNA甲基化酶抑制剂筛选方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种高效的tRNA甲基化酶抑制剂筛选方法。

技术介绍

[0002]小分子药物筛选是药物发现的基础，药物发现过程经历了体内表型筛选、组织和器官表型筛选、基于分子靶点的筛选以及体外表型筛选等发展过程。20世纪初，随着合成和药物化学的发展，基于整体动物的表型筛选得到了迅速发展；50～60年代，由于对酶和酶动力学研究的不断深入，基于组织和器官的表型筛选得到了迅速发展；70年代，酶动力学的方法学研究延伸应用到受体药理学，受体药理学逐渐成为药物发现的热点研究领域；80年代后期，分子生物学和基因组学的发展开启了基于分子靶点的药物发现时代；20世纪90年代，组合化学迅速发展，极大地促进了高通量筛选的发展。近年来，随着细胞生物学、分子药理学、病理生理学和计算机技术等学科的发展与交叉，药物作用机制被不断阐明，促使药物筛选由整体动物水平转变为体外水平的检测实验。
[0003]先导化合物的发现是药物创新的源头，能否发现新颖且成药性好的先导化合物，直接关系到一个药物创新项目的成败，高通量筛选是先导化合物发现的主要手段之一。通过初步筛选出先导化合物后，研究者将基于结构导向等抑制剂设计理念，优化合成一系列衍生物，改善和设计新型骨架化合物。
[0004]其中，虚拟筛选、相似性搜索结合生物活性测定，荧光偏振技术等药物初步筛选方法被广泛应用。例如，荧光偏振技术应用于m6A修饰FTO蛋白小分子抑制剂筛选，通过分析荧光偏振值，发现了非甾体抗炎药甲氯芬那酸(MA)可用于抑制FTO的去甲基化。然而，荧光偏振技术等筛选方法存在着弊端，例如，由于化合物颜色干扰或其他原因，可能会出现一些假阳性化合物也会导致荧光偏振值偏低。除此之外，基于结构的虚拟筛选更是被广泛使用。虚拟筛选通过大分子靶点的三维结构和上百万个小分子的对接，将预测结果打分进行排列，排在前0.1～2.5％的小分子进行下一步的分析和实验验证。虚拟筛选的优点是只需取打分靠前的化合物进行测试。但虚拟筛选也存在着其不确定性，首先，虚拟筛选需要受体的三维结构，且受体具有柔性；其次，虚拟筛选打分存在不确定性，因此往往会漏掉一些潜在的化合物。再者，在数据库中选择多大部分的化合物能得到活性小分子也存在不确定性，也存在较大可能导致选择失败。
[0005]表观遗传学是指基于非基因序列改变所致的基因表达水平变化，是遗传物质DNA或染色质的修饰，但这种修饰并不会改变原有的核苷酸序列。近年来，RNA修饰逐渐成为研究热点，越来越多的研究发现，RNA上的转录后修饰异常被揭示与肿瘤等疾病的发生发展密切相关，研究最多的RNA表观遗传修饰主要包括m1A，m5C，m6A，m7G等。随着这些表观遗传修饰可逆的规律以及参与修饰过程的关键因子逐步被揭示，目前，DNA甲基化抑制剂(DNMT抑制剂)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC抑制剂)已部分投入临床使用并取得一定疗效，但RNA修饰相关的表观遗传药物研究目前处于初级阶段，开发针对RNA修饰的表观遗传药物以用
于异常RNA修饰的逆转具有较好的前景，是一种潜在的癌症治疗策略。因此，建立高通量药物筛选模型靶向RNA修饰过程筛选能抑制RNA修饰相关等小分子先导化合物，对于后续药物研发至关重要。
[0006]本专利技术公开的一种高效的tRNA甲基化酶抑制剂筛选方法，相比于荧光偏振技术等上述目前已存在的高通量筛选先导化合物方法，通过在体外构建并优化RNA相关表观遗传修饰反应(如体外甲基化反应)体系，通过体系中加入待筛选化合物进行反应，结合Dot Blot技术使用特定抗体直接可视化药物筛选结果，提供了一种简便有效，低成本且特异性强的一种高效的tRNA甲基化酶抑制剂筛选方法。通过本专利技术揭示的高效先导化合物用于后续进一步细胞，分子等体内实验验证，对促进其功能、机制研究与药物发现研究具有重要意义。
[0007]用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究的技术称为免疫组织化学(IHC)或者免疫细胞化学(ICC)。免疫组化具有特异性强、灵敏度高、定位准确等特点。
[0008]以往，对组织或细胞中RNA中的甲基化水平进行检测，常广泛使用液相色谱
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串联质谱法(LC
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MS/MS)等方式定量检测甲基化修饰水平；也有相关文献通过Northwestern Blot实验使用相关修饰特定抗体，半定量检测RNA甲基化修饰水平的变化等。另外，体外甲基化反应后，甲基化酶活性和甲基化修饰水平的改变常通过检测甲基化产物SAH的水平进而定量。以上方法均具有其可行性，但他们均需在检测筛选结果前期从反应后溶液中提取RNA并进行相应处理，步骤较为繁琐。Dot Blot是生物学实验中常用的检测和分析方法，可做半定量分析，耗时短操作简便。将待测样品滴加到纤维素膜(或尼龙膜、NC膜)上，然后通过烘烤或紫外线照射来固定样品，用探针进行杂交，然后清洗(除去未接合的探针)，放射自显影，通过显影斑点的有无及颜色的深浅来判断是否有目标产物。在操作流程中，关键步骤是加样如果加样时操作失误，可能会使得反应物在膜上扩散，使显影后的区域呈现出非斑点状，影响实验结果的美观，还会因为样品的分散，干扰结果分析，也会影响到结果分析的准确性。严重的样品扩散会导致样品孔之间交叉污染，直接导致实验结果的不准确或实验失败。多管吸印仪能减少实验过程的失误，提高成功率，但会使得操作步骤繁琐，引入更多误差因素。
[0009]本专利技术项通过Dot blot技术，直接有效地转移RNA体外甲基化反应溶液至尼龙膜，通过特异的抗原抗体反应半定量检测在不同小分子化合物影响下，RNA甲基化修饰水平的改变。这不仅大大简化了繁琐的配胶，电泳，转膜等实验操作，同时也有效避免了该过程中RNA的降解，减少了实验误差，操作较为方便，有一定的推广价值，有利于后续针对不同化合物库进行大批量的小分子抑制剂筛选。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的在于提出一种高效的tRNA甲基化酶抑制剂筛选方法，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。为实现上述技术目的，本专利技术技术方案如下：
[0011]一种高效的tRNA甲基化酶抑制剂筛选方法，所述方法包括以下步骤：
[0012]构建带有His标签的质粒获得重组质粒，将重组质粒转化进入感受态细胞中；将带
有感受态细胞的菌液涂布到固体培养基中，孵育过夜，加入IPTG，诱导蛋白表达；纯化获得的蛋白；配制甲基化缓冲液和tRNA
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Phe GAA储存液，混合前述纯化后的蛋白、甲基化缓冲液和tRNA
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Phe GAA储存液、甲基供体SAM，RNA酶抑制剂RNasin，无酶水获得酶反应复合物；在孔板的每孔中加入tRNA甲基化酶抑制剂和酶反应复合物，震荡斡旋，混匀离心后在PCR仪中孵育，之后加热使酶失活，之后置于冰上；每孔加入10X SSC溶液，得到反应最终物。
[0013]对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效的tRNA甲基化酶抑制剂筛选方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：构建带有His标签的质粒获得重组质粒，将重组质粒转化进入感受态细胞中；将带有感受态细胞的菌液涂布到固体培养基中，孵育过夜，加入IPTG，诱导蛋白表达；纯化获得的蛋白；配制甲基化缓冲液和tRNA
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Phe GAA储存液，混合前述纯化后的蛋白、甲基化缓冲液和tRNA
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Phe GAA储存液、甲基供体SAM，RNA酶抑制剂RNasin，无酶水获得酶反应复合物；在孔板的每孔中加入tRNA甲基化酶抑制剂和酶反应复合物，震荡斡旋，混匀离心后在PCR仪中孵育，之后加热使酶失活，之后置于冰上；每孔加入10X SSC溶液，得到反应最终物。2.根据权利要求1所述一种高效的tRNA甲基化酶抑制剂筛选方法，其特征在于，对每孔中的反应最终物进行Dot Blot分析，扫描Dot Blot的膜片获得体外反应筛选体系的Dot Blot扫描图，每个孔中的反应最终物对应一个tRNA甲基化酶抑制剂或者空白对照，每个孔中的反应最终物作为一个样本，Dot Blot的膜片可以是纤维素膜或尼龙膜、NC膜。3.根据权利要求1所述一种高效的tRNA甲基化酶抑制剂筛选方法，其特征在于，所述方法还包括：对Dot Blot扫描图中小分子化合物样本进行分类；分析分类后的小分子化合物样本，获得缺陷样本，修复缺陷样本，进行小分子化合物筛选。4.根据权利要求3所述一种高效的tRNA甲基化酶抑制剂筛选方法，其特征在于，对Dot Blot扫描图中小分子化合物样本进行分类的子步骤为：通过边缘检测算子对灰度化的Dot Blot扫描图进行边缘检测，边缘检测得到的边缘曲线将扫描图分为多个封闭区域，使所有封闭区域中积大于0.8X的封闭区域构成封闭集合A，X为孔板底部开孔的大小，获得对照样品的灰度值为GBG；背景区域指没有加入任何试剂的膜片区域或者tRNA甲基化酶抑制剂的空白对照孔；封闭区域集合A＝{GRYi}，i＜N，N为膜上测试点的数量，GRYi为膜上第i个点；获取封闭区域集合A中所有封闭区域中孔板对应膜片区域的像素点灰度值的极值，最大值GMAX与最小值GMIN与平均值GAVG，GMIN∈[0,255]，GMAX∈[0,255],GAVG∈[0,255]，GMAX＞GAVG，GMIN＜GAVG；设置第一条件和第二条件：第一条件：如果abs(GAVG
‑
GMIN)＞abs(GAVG
‑
GMAX)则设置第一灰度阈值为GMIN+(GMAX
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GAVG)，否则设置第一灰度阈值为(GMIN+GMAX
×
GMIN/GAVG)；封闭区域中所有像素的灰度值的算术平均值超过第一阈值；第二条件：封闭区域的边缘长度Arc＞log
10
(CD)
×
exp(d/2)；其中，CD为封闭区域的圆正度，CD＝S
×
4π/(d/2)2，式中d为Dot Blot孔板底部开孔的直径，S为封闭区域的面积，π取3.14，log10()为以10为底的对数函数，exp()为以自然对数为底的指数函数；步骤3.1，初始化空集合第一集合UPA和第二集合DWA，把封闭区域集合A中符合第一条件或者第二条件的封闭区域并放入第一集合UPA，把封闭区域集合A中同时不符合第一条件和第二条件的封闭区域放入第二集合DWA；步骤3.2，输出第一集合UPA和第二集合DWA。5.根据权利要求3所述一种高效的tRNA甲基化酶抑制剂筛选方法，其特征在于，分析分
类后的小分子化合物样本，获得缺陷样本，修复缺陷样本，进行小分子化合物筛选的子步骤为：步骤4.1，遍历第一集合UPA中...

【专利技术属性】
技术研发人员：林水宾，郑思仪，马结仪，朱艳，
申请(专利权)人：中山大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：