一种基于纳米孔的免标记甲基转移酶传感器的制备及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种免标记甲基转移酶的检测方法及其用途。所述单锥形纳米孔道由苯二甲酸乙二醇酯(PET)核孔膜用径迹刻蚀法制备，经过聚乙烯亚胺和锆离子修饰后作为信号输出装置。结合DNA级联信号放大反应，开发了一种超灵敏、无标记的DNA腺嘌呤甲基化甲基转移酶(Dam

【技术实现步骤摘要】
H1‑
H4(各500nM)，在37℃下进行1h的均相CHA
‑
HCR反应。然后，向离心管中添加500μg/mL氧化石墨烯(100μL)并反应0.5h。随后，使用Tris
‑
HCl缓冲液将所得溶液稀释至1mL。最后，将产物溶液放置在纳米孔的尖端侧，通过扫描电压从
‑
1V到+1V，可以获得电流
‑
电压曲线。当溶液中存在甲基转移酶的时候，发夹序列H
D
的相应识别位点被甲基化，并被DpnI核酸内切酶特异性切割，释放DNA片段，触发催化发夹组装和杂交链式反应(CHA
‑
HCR)。生成的产物可以吸附在Zr
4+
包覆的纳米孔上，引起离子整流信号的改变。实现了对Dam甲基转移酶的选择性检测。
附图说明
[0007]图1聚合物纳米孔的扫描电镜(SEM)表征。(A)大孔端(B)小孔端；
[0008]图2聚乙烯亚胺/Zr
4+
修饰的纳米孔用于甲基转移酶检测的示意图。
[0009]图3CHA
‑
HCR扩增反应系统中加入(a)H
D
发夹序列，(b)H
D
发夹序列+Dam甲基转移酶，(c)H
D
发夹序列+DpnI核酸内切酶，(d)H
D
发夹序列+Dam甲基转移酶+DpnI核酸内切酶后的电流
‑
电压曲线。
[0010]图4(A)在CHA
‑
HCR扩增反应系统的纳米孔道的电流
‑
电压曲线随Dam甲基转移酶浓度变化的趋势；(B)相应的离子电流变化值(I0‑
I)对Dam甲基转移酶浓度的对数值作图；
[0011]图5(A)在CHA
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HCR扩增反应系统中，加入1U/mL M.SssI甲基转移酶，10U/mL M.SssI甲基转移酶和1U/mL Dam甲基转移酶时通过纳米孔道的电流
‑
电压曲线。(B)在CHA
‑
HCR扩增反应系统中，加入1U/mL M.SssI甲基转移酶，10U/mL M.SssI甲基转移酶和1U/mL Dam甲基转移酶时在+1V电压下纳米孔离子电流变化值的柱状图；
具体实施方式
[0012]以下将结合实施例对本专利技术做进一步说明，本专利技术的实施例仅用于说明本专利技术的技术方案，并非限定本专利技术。
[0013]实施例1
[0014]我们使用径迹蚀刻技术在12μm聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜中制备了单个锥形纳米通道。在化学蚀刻之前，将PET膜的每一侧置于波长为365nm的紫外光下1h。PET膜夹在定制设计的蚀刻池的两个腔室之间，其中一个腔室含有60℃的蚀刻溶液(6M NaOH)，另一个腔室含有60℃的停止溶液(1M HCOOH+1M KCl)。蚀刻过程由一对铂电极监测，电极电压为1V。当电流达到所需电流值时，停止蚀刻，并将膜快速浸入水中以去除残余盐。用场发射扫描电子显微镜测量了纳米孔的小孔端和大孔端直径。如图1A和1B所示，纳米孔的小孔端直径约为85nm，而纳米孔的大孔端直径约为1.14μm。化学蚀刻后，纳米孔表面富含大量的羟基和羧基。
[0015]将膜浸入1％聚乙烯亚胺(PEI)中10h，通过静电吸附将PEI改性到纳米预处理表面。接下来，将乙酸锆(8％wt水溶液)添加到纳米孔的小孔端并修饰0.5h。
[0016]实施例2
[0017]离子电流由Keithley 6487皮安计/电压源测量。纳米孔膜固定在两个充满Tris
‑
HCl缓冲液(pH＝7.5、100mM KCl和10mM Tris
‑
HCl)的腔室之间。将一对Ag/AgCl电极插入两个腔室中以测量穿过纳米孔的离子电流。
[0018]将实施例中制备的纳米孔传感器应用于水样中四环素的分析检测，其具体操作方法及结果如下应用实例：
[0019]应用实例1
[0020]甲基化实验在50μL Dam甲基化酶反应缓冲液(由NEB公司提供)中进行。2μL H
D
(2μΜ)与5μL SAM(1600μM)、40U/mL DpnI、5μL Cutsmart缓冲液(10
×
)和不同浓度的Dam MTase在37℃下孵育2小时。随后，向Dam/DpnI处理过的溶液中添加发夹探针H1‑
H4(各500nM)，以在37℃下进行1h的均相CHA
‑
HCR反应。然后，向离心管中添加500μg/mL氧化石墨烯(100μL)并反应0.5h。随后，使用Tris
‑
HCl缓冲液将所得溶液稀释至1mL。最后，将产物溶液放置在纳米孔的尖端侧，通过扫描电压从
‑
1V到+1V，可以获得电流
‑
电压曲线(图4A)。从图4A可以看出，在加入甲基转移酶之前，离子整流曲线呈现向上翘的趋势，这是因为缺乏Dam甲基转移酶，内切酶DpnI无法完成对探针H
D
特定位点的切割，均相CHA
‑
HCR反应无法进行。因此纳米孔表面带大量正电。当溶液中存在甲基转移酶的时候，发夹序列H
D
的相应识别位点被甲基化，并被DpnI核酸内切酶特异性切割，释放DNA片段，触发催化发夹组装和杂交链式反应(CHA
‑
HCR)。生成的产物可以吸附在Zr
4+
包覆的纳米孔上，引起离子整流信号的改变，从而实现了对Dam甲基转移酶的选择性检测。Dam甲基转移酶的浓度和电流信号之间具备较好的浓度依赖关系。经试验测定，离子电流的变化值(+1V处)和Dam甲基转移酶浓度的对数值呈线性关系。说明我们可以通过离子电流的变化值来定量生物样品中Dam甲基转移酶的浓度。
[0021]应用实例2
[0022]分别向体系中加入多种甲基转移酶，如1U/mL Dam甲基转移酶，1U/mL M.SssI甲基转移酶，10U/mL M.SssI甲基转移酶。测试离子电流，检验该纳米孔传感器对Dam甲基转移酶的特异性。图5所示为多种甲基转移酶检测的离子整流曲线和选择性柱状图。如图所示，只有Dam甲基转移酶可以协助DpnI内切酶完成对甲基化位点的切割，从而引发CHA
‑
HCR反应，引起纳米孔传感器信号的改变，其他甲基转移酶无法协助DpnI内切酶对特定位点的切割，因此没有电流信号变化，这是由酶本身的特异性所决定的。说明了该纳米孔传感器对Dam甲基转移酶的测定具有高选择性。因此，本专利技术所述纳米孔传感器可以用来检测样品中甲基转移酶的浓度。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种免标记甲基转移酶传感器的制备及应用，其特征在于，所述的聚合物纳米孔道是基于核孔膜表面通过不对称的径迹刻蚀法制备得到的。制得的纳米孔道的大端孔径为1.14μm，小端孔径为85nm。在纳米孔道内壁修饰聚乙烯亚胺和锆离子。当存在Dam甲基转移酶的情况下，发夹序列H
D
的相应识别位点被甲基化，并被DpnI核酸内切酶特异性切割，释放DNA片段，触发催化发夹组装和杂交链式反应(CHA
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HCR)。生成的产物可以吸附在Zr
4+
包覆的纳米孔上，并输出离子电流整流信号，实现了对Dam甲基转移酶的选择性检测。2.如权利要求1所述的纳米孔道作为检测Dam甲基转移酶的分析方法的应用。3.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：张思奇，施伟，厉凯彬，
申请(专利权)人：台州学院，
类型：发明
国别省市：