【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学领域，具体涉及高表达lncrna h19基因的腺病毒载体、重组腺病毒及其应用。
技术介绍
1、下肢缺血性疾病是一种严重的血液循环障碍，可能导致组织缺血、坏死和功能丧失，而外科血运重建、血管腔内治疗、截肢及药物等治疗方法目前均未能有效逆转重症下肢缺血状态。内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells，epcs)是一类存在于骨髓及周围血液中的干细胞，它们具有再生内皮和血管修复的能力，然而未经改造的内皮祖细胞在外周阻塞性疾病等缺血缺氧环境下成活率低，增殖分化能力弱，导致内皮祖细胞疗效不显著；此外，由于下肢缺血肢体长期处于缺血缺氧状态，目前报道的体外修饰改造后的内皮祖细胞在此环境下的存活率仍较低，恢复缺血肢体的血流效果仍一般，无法逆转肢体缺血状态。
2、长链非编码rna(longnon-codingrna，lncrna)定义为一类长度大于200nt，不编码蛋白质的rna转录产物，仅仅是rna聚合酶ii转录副产物，不具有生物学功能。然而，近年来的研究表明，lncrna参与了x染色体沉默，基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输、蛋白质翻译后的修饰以及遗传学的表观调控等多种重要的调控过程，这些作用表明其与疾病的病理生理改变有着紧密联系。人lncrna h19位于人染色体11p15.5，全长2.3kb，是最先被报道的lncrna基因之一，据报道lncrna h19在血管新生、血管功能和炎症反应等方面可以发挥作用，其可能通过调控相关基因或mirna的表达，影响内皮祖细胞的增殖和
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点和不足而提供一种高表达lncrna h19基因的腺病毒载体、重组腺病毒及其应用，所述重组腺病毒通过体外感染正常培养的外周血内皮祖细胞即可获得高表达lncrna h19的内皮祖细胞，操作方法简单，调控水平显著，且能实现lncrna h19的持续稳定高表达。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：
3、第一方面，本专利技术提供一种腺病毒载体，所述腺病毒载体采用以下方法制备而成：将长链非编码rna h19基因进行扩增，并将扩增后的长链非编码rna h19基因插入腺病毒穿梭载体质粒gv315的agei和nhei位点之间；由cmv启动子调控长链非编码rna h19基因表达，即得到所述腺病毒载体；
4、所述长链非编码rna h19基因进行扩增的上游引物如seq id no:1所示，下游引物如seq id no:2所示。
5、本专利技术选取穿梭质粒gv315作为载体，通过设计引物对长链非编码rna h19基因进行扩增后经过同源重组技术将其插入gv315的agei和nhei位点之间，并由cmv启动子进行基因表达调控，实现了长链非编码rna h19基因在宿主细胞中的高效表达，且稳定性高，确保基因在宿主细胞中的长期存在，同时方便克隆和筛选。
6、经试验探究发现，本专利技术构建的携带长链非编码rna h19基因的重组腺病毒载体，能有效介导调控长链非编码rna h19的表达水平，利用其转染内皮祖细胞可以将内皮祖细胞内的长链非编码rna h19上调10万倍以上，调控水平显著，且操作方法简单，相较于慢病毒调控改造的内皮祖细胞，本专利技术利用构建的重组腺病毒介导制备内皮祖细胞所用时间缩短了将近2周。
7、优选地，所述扩增后的长链非编码rna h19基因插入腺病毒穿梭载体质粒gv315的agei和nhei位点之间的方法为：通过ecor i限制性内切酶酶切扩增后的长链非编码rnah19基因序列和穿梭载体质粒gv315，然后将酶切后的长链非编码rna h19基因序列和穿梭载体质粒gv315连接。
8、第二方面，本专利技术提供一种重组腺病毒，所述重组腺病毒由上述腺病毒载体及腺病毒辅助骨架质粒共转染包装细胞，在包装细胞中重组包装并收集得到。
9、优选地，本专利技术采用脂质体转染法进行共转染，包括以下步骤：
10、(1)将包装细胞接种于含5-10％fbs的dmem培养基中，36-38℃、5％co2条件下培养；
11、(2)将所述腺病毒载体及腺病毒辅助骨架质粒与dmem混合均匀，孵育5-10min；
12、(3)将lipofectamine 2000试剂与dmem混合均匀，孵育5-10min；
13、(4)将步骤(2)的混合液与步骤(3)的混合液混匀，孵育15-25min，得到转染复合液；
14、(5)将步骤(4)的转染复合液滴加至步骤(1)的包装细胞培养液中，36-38℃、5％co2条件下培养，6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入pbs洗涤残余的转染混和物，倒弃废液，再加入含10％血清的细胞培养基，37℃、5％co2条件下培养10-15d，离心收集细胞，即完成脂质体转染法共转染过程。
15、本专利技术通过lipofectamine 2000脂质体转染法对腺病毒载体及辅助骨架质粒共转染包装细胞，操作方法简便，条件温和，具有相对较低的生物毒性，且能实现相对较高的转染效率，有助于维持细胞的健康状态和提高外源基因表达的稳定性。
16、更优选地，所述腺病毒载体、腺病毒辅助骨架质粒和lipofectamine 2000试剂的质量体积比为腺病毒载体：腺病毒辅助骨架质粒：lipofectamine 2000试剂＝1μg:1μg:2μl；所述步骤(1)中，培养基中细胞密度达到50-60％。
17、经试验探究发现，当腺病毒载体、腺病毒辅助骨架质粒和lipofectamine 2000试剂的质量体积比1μg:1μg:2μl时，能获得最佳的转染效率，且避免细胞毒性的产生；转染效率也与细胞密度有关，当细胞密度为50-60％时，能保证良好的细胞状态和较少的传代次数，同时能明显提高腺病毒的转染效率。
18、优选地，所述腺病毒辅助骨架质粒为pbhg。
19、优选地，所述包装细胞为hek293细胞。
20、优选地，还包括：将收集得到的重组腺病毒作为毒种进行扩大培养；
21、优选地，所述扩大培养直至获得第二代重组腺病毒为止。
22、所述扩大培养包括如下步骤：将收集得到的重组腺病毒粗提液加入含生长状态良好，且细胞密度达到60％的宿主细胞的培养基中培养，待大部分细胞出现典型的细胞病发(cpe)，且有50％细胞脱壁时，离心收集细胞，反复冻融，收集病毒上清，再将病毒上清加入含密度达到90％的宿主细胞的培养基中培养，待大部分细胞出现典型的细胞病发，且有50％细胞脱壁时，再次离心收集细胞，反复冻融，收集病毒上清，获得第二代重本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种腺病毒载体，其特征在于，所述腺病毒载体采用以下方法制备而成：
2.根据权利要求1所述的腺病毒载体，其特征在于，所述扩增后的长链非编码RNA H19基因插入腺病毒穿梭载体质粒GV315的AgeI和NheI位点之间的方法为：通过EcoR I限制性内切酶酶切扩增后的长链非编码RNA H19基因序列和穿梭载体质粒GV315，然后将酶切后的长链非编码RNA H19基因序列和穿梭载体质粒GV315连接。
3.一种重组腺病毒，其特征在于，所述重组腺病毒由权利要求1-2任一项所述腺病毒载体及腺病毒辅助骨架质粒共转染包装细胞，在包装细胞中重组包装并收集得到。
4.根据权利要求3所述的重组腺病毒，其特征在于，所述腺病毒载体及腺病毒辅助骨架质粒采用脂质体转染法进行共转染，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的重组腺病毒，其特征在于，所述步骤(1)中，所述培养基中细胞密度达到50-60％；
6.根据权利要求3所述的重组腺病毒，其特征在于，所述腺病毒辅助骨架质粒为pBHG；所述包装细胞为HEK293细胞。
7.根据权利要求3
8.一种转基因细胞，其特征在于，所述转基因细胞由权利要求3-7任一项所述的重组腺病毒转染内皮祖细胞中得到。
9.根据权利要求8所述的转基因细胞，其特征在于，所述内皮祖胞为传代后的第3-6代之间的内皮祖细胞。
10.根据权利要求8所述的转基因细胞，其特征在于，所述内皮祖细胞的接种密度为40-70％；所述重组腺病毒的转染时间为72h。
11.根据权利要求8所述的转基因细胞，其特征在于，权利要求3-7任一项所述的重组腺病毒对内皮祖细胞的最佳感染复数为150-200MOI。
12.权利要求8-11任一项所述的转基因细胞在制备治疗缺血性疾病的细胞制剂中的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种腺病毒载体，其特征在于，所述腺病毒载体采用以下方法制备而成：
2.根据权利要求1所述的腺病毒载体，其特征在于，所述扩增后的长链非编码rna h19基因插入腺病毒穿梭载体质粒gv315的agei和nhei位点之间的方法为：通过ecor i限制性内切酶酶切扩增后的长链非编码rna h19基因序列和穿梭载体质粒gv315，然后将酶切后的长链非编码rna h19基因序列和穿梭载体质粒gv315连接。
3.一种重组腺病毒，其特征在于，所述重组腺病毒由权利要求1-2任一项所述腺病毒载体及腺病毒辅助骨架质粒共转染包装细胞，在包装细胞中重组包装并收集得到。
4.根据权利要求3所述的重组腺病毒，其特征在于，所述腺病毒载体及腺病毒辅助骨架质粒采用脂质体转染法进行共转染，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的重组腺病毒，其特征在于，所述步骤(1)中，所述培养基中细胞密度达到50-60％；
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【专利技术属性】
技术研发人员：姚陈，黄林，王康杰，王折存，孙云昊，邓堂，周志豪，武日东，
申请(专利权)人：中山大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：
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