一种转座酶活性测定方法技术

本发明专利技术涉及一种转座酶活性测定方法，尤其是Tn5转座酶活性测定方法，包括：将转座酶与含有转座酶识别序列的底物结合，进行打断反应，将上述打断后的产物进行qPCR检测，根据Ct值评价转座酶的活性。本发明专利技术的方法可以对转座酶的活性进行较为精确的测定，从而评价转座酶的活性，并且本发明专利技术的方法所需的测活时间短。并且本发明专利技术的方法所需的测活时间短。

【技术实现步骤摘要】
一种转座酶活性测定方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种转座酶活性测定方法。

技术介绍

[0002]目前高通量测序技术的建库过程，根据打断方式的不同可以分为两种方法，分别为物理法和酶法，物理法包括雾化和超声打断DNA，酶法包括DNA片段化酶(Fragmentase)、DNA剪切酶(Shearase)和转座酶(Tn5 Transposase)等，除转座酶外，其他的所有建库方法都包含打断DNA，修复DNA片段和DNA片段加接头几个步骤。使用转座酶建库时，超高活性Tn5转座酶能够对DNA分子进行非特异性的随机切割，仅一步就可以完成打断DNA和DNA片段加接头的过程，使建库反应在2个小时内完成。与传统的机械法片段化DNA相比较，Tn5转座酶处理样品的通量更大、流程更为简便、更节约时间。另外传统的超声机械打断仪价格昂贵，Tn5转座酶处理样本更节约成本。因此可替代传统的超声机械法，应用于高通量测序中的DNA文库构建。
[0003]根据Tn5转座酶法进行DNA片段化，将繁琐的DNA片段化、末端修复和接头连接反应等步骤变为一步简单的酶促反应这一特点，建库技术得到了很大的进步，进一步拓展了NGS的适用范围，同时在分子诊断、表观遗传领域也衍生出许多新技术，产生更加广泛、更加多元化的应用。例如：长片段读取、单细胞微量建库、ATAC
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seq、CUT&Tag等。
[0004]目前，针对转座酶的测活方法，已有一些文献和专利报道。例如一些报道中，酶活定量测定方法通过转位反应/转化实验，采用阳性菌斑计数的方法测定。使用转座酶和报告基因构建成转座复合体，同时将报告基因导入质粒中，将构建的含有报告基因的质粒转化进入到大肠杆菌细胞中，通过检测细菌(或显色细菌)在抗性平板上的菌斑数量来间接检测转座酶的活性。通过阳性菌斑计数的方法测定转座酶活性，该方法涉及的大肠杆菌转化实验本身的稳定性和重复性较差，转化的效率与感受态细胞的稳定性和效价密切相关，同时转化产生的菌落往往无法精确计数，因此该方法更适合于定性分析而不适合定量分析转座酶的活性；并且实验涉及到细菌培养，整体测活反应时间较长。
[0005]CN108265101A公开了一种快速稳定的Tn5转座酶酶活测定方法，使用一种易于检测的Tn5转座酶底物，当Tn5转座酶和测活底物混合后，Tn5转座酶识别测活底物序列中的末端序列，进而催化转座反应，将底物DNA切断，释放带有标记的DNA片段。未反应的底物可以通过能够识别底物标记的介质，经过介质吸附和介质移除的方式去除。通过检测被释放的DNA片段的含量，同标准数据比对，来计算出Tn5转座酶的酶活。
[0006]目前针对转座酶活性测定和功能评价之间，缺乏统一的标准和科学的方法，使得Tn5转座酶的生产中，不同批次间酶活测定和比较难以控制。本专利技术目的在于提供一种稳定、快速测定转座酶活性的方法，能够检测并控制转座酶生产批次间差异，表征转座酶的稳定性，助力更加高标准、高质量的单细胞/分子级的产品开发。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供了一种转座酶活性测定方法，所述方法包括：
[0008](1)将转座酶与含有转座酶识别序列的底物结合，进行打断反应；
[0009](2)将上述打断后的产物进行qPCR检测，根据Ct值评价转座酶的活性。
[0010]在一些实施方案中，所述测定方法还包含构建含有转座酶识别序列的底物的步骤。
[0011]本专利技术还提供了一种转座酶活性检测试剂盒，试剂盒包含：含有转座酶识别序列的底物、检测引物。
[0012]在一些实施方案中，所述转座酶可选自Tn5、MuA、IS5、IS91或哈氏弧菌转座酶，或其活性突变体。
[0013]在一些实施方案中，所述的转座酶是Tn5转座酶。
[0014]在一些实施方案中，所述的转座酶是Tn5转座酶，转座酶识别序列可选自Tn5转座酶序列的内端(inside end，IE)、外端(outside end，OE)和嵌合端(mosaic end，ME)序列，即IE、OE或ME序列。
[0015]在一些实施方案中，所述的含有转座酶识别序列的底物中含有不限数量的识别序列，例如可以是1～100个，优选含有2个。
[0016]在一些实施方案中，所述的含有转座酶识别序列的底物结构是X
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识别序列1
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Y
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识别序列2
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Z，其中X、Y、Z选自随机核酸序列或不存在，并且X、Y、Z至少一个是随机核酸序列，识别序列1或2为转座酶识别序列。
[0017]在一些实施方案中，所述的含有转座酶识别序列的底物结构是X
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识别序列1
‑
Y
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识别序列2
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Z，其中X、Y、Z均选自随机核酸序列且各不相同，识别序列1或2为转座酶识别序列。
[0018]在一些实施方案中，所述的转座酶是Tn5转座酶，所述的含有转座酶识别序列的底物结构是X
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识别序列1
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Y
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识别序列2
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Z，其中X、Y、Z均选自随机核酸序列且各不相同，识别序列1或2选自IE、OE或ME序列。在一些实施方案中，所述的转座酶识别序列1和2是相同的。在一些实施方案中，所述的转座酶识别序列1和2均为ME序列。
[0019]本专利技术还提供了一种Tn5转座酶活性测定方法，所述方法包括：
[0020](1)将Tn5转座酶与含有Tn5转座酶识别序列ME的底物结合，进行打断反应；
[0021](2)将上述打断后的产物进行qPCR检测，根据Ct值评价转座酶的活性。
[0022]在一些实施方案中，所述的含有Tn5转座酶识别序列ME的底物结构是X
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ME
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Y
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ME
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Z，其中X、Y、Z选自随机核酸序列。在一些实施方案中，所述的含有Tn5转座酶识别序列ME的底物结构是X
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ME
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Y
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ME
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Z，其中X、Y、Z选自随机核酸序列，且X、Y、Z互不相同。
[0023]在一些实施方案中，所述的X的序列长度选自50～1000bp，优选100～500bp，更优选300～400bp。在一些实施方案中，所述的Y的序列长度选自50～5000bp，优选100～1000bp，更优选200～800bp。在一些实施方案中，所述的Z的序列长度选自50～1000bp，优选100～500bp，更优选100～200bp。
[0024]在一些实施方案中，所述Tn5转座酶活性测定方法，包括：
[0025](1)将Tn5转座酶与含有Tn5转座酶识别序列ME的底物结合，进行打断反应，所述底物结构是：A序列
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ME序列(19bp)
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C序列
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ME序列(1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种转座酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括：(1)将转座酶与含有转座酶识别序列的底物结合，进行打断反应；(2)将上述打断后的产物进行qPCR检测，根据Ct值评价转座酶的活性。2.根据权利要求1所述的测定方法，其中所述转座酶选自Tn5、MuA、IS5、IS91或哈氏弧菌转座酶，或其活性突变体，优选Tn5转座酶或其活性突变体。3.根据权利要求1所述的测定方法，其中所述的转座酶是Tn5转座酶，转座酶识别序列可选自IE、OE、ME序列。4.根据权利要求1所述的测定方法，其中，所述含有转座酶识别序列的底物结构是X
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识别序列1
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Y
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识别序列2
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Z，其中X、Y、Z选自随机核酸序列或不存在，并且X、Y、Z至少一个是随机核酸序列，识别序列1或2为转座酶识别序列。5.根据权利要求4所述的测定方法，其中X、Y、Z均选自随机核酸序列且各不相同，识别序列1或2选自IE、OE或ME序列，优选ME序列。6.一种Tn5转座酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括：(1)将Tn5转座酶与含有Tn5转座酶识别序列ME的底物结合，进行打断反应；(2)将上述打断后的产物进行qPCR检测，根据Ct值评价转座酶的活性。7.根据权利要求6所述的测定方法，其中，含有Tn5转座酶识别序列ME的底物结构是X
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ME<...

【专利技术属性】
技术研发人员：瞿志鹏，江明扬，唐秋雨，易文洋，
申请(专利权)人：南京诺唯赞生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：