【技术实现步骤摘要】
本申请属于生物，涉及一种高活性的肌酐酶及肌酐酶的冻干剂。
技术介绍
1、肌酐是人体肌肉中的肌酸通过自发的且不可逆转的过程形成的，在肾脏功能正常情况下，肌酐在血液中的浓度维持在一个较低的水平，而肾脏功能不全时，会导致肌酐在血清中的积累，血清中肌酐含量是反映肾脏功能的重要指标。
2、对于肌酐的检测，应用最为广泛的是碱性苦味酸法，即以肌酸为底物，在肌酐酶的催化作用下使肌酸转化为肌酐，肌酐在碱性条件下与苦味酸发生反应，生成橘黄色产物，在520nm的可见波长下其浓度与吸光度成正比，因此可以通过测定肌酐的生成量来测定肌酐酶酶活。但存在着反应特异性差与灵敏度有限的问题，目前正逐渐被酶法(肌酐酶偶联肌氨酸氧化酶法)检测所替代，其中肌酐酶(肌酐酰胺水解酶，creatininase，ec.3.5.2.10，简称cine)、肌酸酶和肌氨酸氧化酶是三个关键性的酶，肌酐酶水解肌酐生成肌酸，肌酸酶催化肌酸水解产生肌氨酸和尿素，肌氨酸在肌氨酸氧化酶作用下水解生成甲醛、甘氨酸和h2o2，偶联trinder反应，通过比色测定，计算出样品中肌酐的含量。酶法具有抗干扰能力强、特异性好、线性范围宽、灵敏度高等特点，商品化的试剂盒大多采用肌酐酶偶联肌氨酸氧化酶法，在临床上得到了越来越多的使用。
3、肌酐酶是酶法检测肌酐的核心原料，因此肌酐酶的制备方法和长期储存稳定性具有重要意义。目前，工业生产肌酐酶多采用基因工程菌发酵的方法，但野生酶产量极低、活性差，难以进行工业化利用。中国的专利申请文件cn115820614a中公开了一种肌酐酶的制备方法及发酵
技术实现思路
1、针对目前肌酐酶产量低、活性差且液体酶储存不方便的状况，寻找一种便于工业化生产、产量高、活性好且运输方便的肌酐酶突变体和其冻干剂生产的方法。
2、一方面，本申请提供一种高活性的肌酐酶突变体。
3、在一些实施方案中，所述突变体与氨基酸序列如seq id no：1所示的野生型肌酐酶相比，含有以下位点上的氨基酸取代：第144位。在一些实施方案中，所述突变体与氨基酸序列如seq id no：1所示的野生型肌酐酶相比，还含有以下位点上的氨基酸取代：第165位。在一些实施方案中，所述突变体与氨基酸序列如seq id no：1所示的野生型肌酐酶相比，还含有以下位点上的氨基酸取代：第198位。在一些实施方案中，突变体与氨基酸序列如seqid no：1所示的野生型肌酐酶相比，含有下列位点上的氨基酸取代组合：第144位、第165位、第198位。
4、在一些实施方案中，所述突变体包含h144t、r165e、e198t取代。在一些实施方案中，所述突变体的序列如seq id no：5所示。
5、另一方面，本申请提供一种多核苷酸，其编码本申请的肌酐酶突变体。在一些实施方案中，所述多核苷酸的序列如seq id no：6所示。
6、另一方面，本申请还提供一种表达载体，其掺入本申请的多核苷酸。在一些实施方案中，所述表达载体掺入有如seq id no：6所示的多核苷酸。在一些实施方案中，所述表达载体是pet载体，具体是pet28a。
7、另一方面，本申请还提供一种宿主细胞，其用本申请所述的多核苷酸转化并表达所述多核苷酸。在一些实施方案中，所述宿主细胞用包含如seq id no：6所示的多核苷酸转化并表达所述多核苷酸。本申请还提供一种宿主细胞，其被用本申请所述的表达载体转化。在一些实施方案中，所述宿主细胞被用掺入有包含seq id no：6所示的多核苷酸的表达载体转化。
8、另一方面，本申请还提供一种在宿主细胞中生产本申请的肌酐酶突变体的方法，所述方法包括在使得产生本申请的突变体的培养条件下培养本申请所述的宿主细胞。在一些实施方案中，所述生产本申请的肌酐酶突变体的方法还包括从培养物和/或宿主细胞回收肌酐酶突变体。在一些实施方案中，还包括对宿主细胞使用异丙基硫代半乳糖苷(iptg)诱导蛋白表达的步骤。在一些实施方案中，所述生产本申请的肌酐酶突变体的方法还包括纯化所述肌酐酶突变体的步骤。在一些实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)。
9、另一方面，本申请还提供一种肌酐酶的冻干剂，包含海藻糖、金属盐和肌酐酶。在一些实施方案中，所述肌酐酶的冻干剂由海藻糖、金属盐和肌酐酶组成。
10、在一些实施方案中，所述金属盐中的金属离子选自亚铁离子、锰离子、镁离子、钙离子、锌离子、铜离子和钴离子。
11、在一些实施方案中，所述冻干剂在冻干前或复溶后的液体中，海藻糖的摩尔浓度是25～100mmol/l，优选50～100mmol/l，更优选50mmol/l、55mmol/l、60mmol/l、65mmol/l、70mmol/l、75mmol/l、80mmol/l、81mmol/l、82mmol/l、83mmol/l、84mmol/l、85mmol/l、86mmol/l、87mmol/l、87.64mmol/l、88mmol/l、89mmol/l、90mmol/l、91mmol/l、92mmol/l、93mmol/l、94mmol/l、95mmol/l或100mmol/l。在一些实施方案中，所述冻干剂中金属离子与海藻糖的摩尔比选自1：25～1：180，优选自1：25、1：29.2、1：30、1：31、1：32、1：33、1：34、1：35、1：36、1：37、1：38、1：39、1：40、1：41、1：42、1：43、1：43.8、1：44、1：45、1：50、1：55、1：56、1：57、1：58、1：58.4、1：59、1：60、1：65、1：70、1：75、1：80、1：81、1：82、1：83、1：84、1：85、1：86、1：87、1：87.6、1：88、1：89、1：90、1：91、1：92、1：93、1：94、1：95、1：100、1：105、1：110、1：115、1：120、1：125、1：130、1：135、1：140、1：145、1：150、1：155、1：160、1：165、1：170、1：171、1：172、1：173、1：174、1：175、1：175.2、1：176、1：177、1：178、1：179或1：180。
12、在一些实施方案中，所述冻干剂中肌酐酶与海藻糖的摩尔比选自1：150～1：900，优选自1：150、1：155、1：160本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种肌酐酶突变体，其中突变体与氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的肌酐酶相比，含有下列位点上的氨基酸取代组合：第144位、第165位、第198位。
2.根据权利要求1的突变体，所述序列如SEQ ID NO：5所示。
3.一种多核苷酸，其编码权利要求1或2所述的突变体。
4.一种表达载体，其掺入有权利要求3所述的多核苷酸。
5.一种宿主细胞，其用权利要求3所述的多核苷酸转化并表达所述多核苷酸。
6.一种肌酐酶的冻干剂，包含海藻糖、金属盐和肌酐酶。
7.根据权利要求6所述的冻干剂，所述金属盐中的金属离子选自亚铁离子、锰离子、镁离子、锌离子、铜离子和钴离子，优选锰离子。
8.根据权利要求7所述的冻干剂，所述金属离子与海藻糖的摩尔比选自1：25～1：180，优选1：35～1：180，更优选自1：25、1：29.2、1：30、1：31、1：32、1：33、1：34、1：35、1：36、1：37、1：38、1：39、1：40、1：41、1：42、1：43、1：43.8、1：44、1：45、1：50、1
9.根据权利要求7所述的冻干剂，所述金属离子和肌酐酶的摩尔比选自2：1～20：1，优选2.5：1～15：1，更优选自2：1、2.82：1、3：1、4：1、5：1、5.6：1、6：1、7：1、8：1、8.45：1、9：1、10：1、11：1、11.3：1、12：1、13：1、14：1、14.2：1、15：1、16：1、16.95：1、17：1、18：1、19：1、20：1。
10.根据权利要求6所述的冻干剂，所述肌酐酶选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQID NO：5所示的肌酐酶。
11.权利要求6-10所述的冻干剂在减少肌酐酶活性在冻干过程中的损失中的应用。
12.海藻糖和金属离子的组合在制备肌酐酶冻干剂中的应用。
13.一种制备肌酐酶冻干制剂的方法，所述方法包括(1)配制肌酐酶、海藻糖和金属盐的混合体系，使混合体系中肌酐酶的浓度为3-6mg/mL，优选4-6mg/mL，更优选5mg/mL，海藻糖浓度为1-5％(m/v)，优选2-4％(m/v)，更优选3(m/v)，金属离子浓度为0.5mM-3mM，优选0.5mM-2.5mM，最优选0.5-1.5mM，(2)将步骤(1)配制的组合物冻干。
14.根据权利要求13所述的方法，所述金属离子选自铁离子、锰离子、镁离子、锌离子、铜离子和钴离子，优选锰离子，所述浓度优选1mM。
15.根据权利要求13所述的方法，所述肌酐酶选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：5所示的肌酐酶。
...【技术特征摘要】
1.一种肌酐酶突变体，其中突变体与氨基酸序列如seq id no：1所示的肌酐酶相比，含有下列位点上的氨基酸取代组合：第144位、第165位、第198位。
2.根据权利要求1的突变体，所述序列如seq id no：5所示。
3.一种多核苷酸，其编码权利要求1或2所述的突变体。
4.一种表达载体，其掺入有权利要求3所述的多核苷酸。
5.一种宿主细胞，其用权利要求3所述的多核苷酸转化并表达所述多核苷酸。
6.一种肌酐酶的冻干剂，包含海藻糖、金属盐和肌酐酶。
7.根据权利要求6所述的冻干剂，所述金属盐中的金属离子选自亚铁离子、锰离子、镁离子、锌离子、铜离子和钴离子，优选锰离子。
8.根据权利要求7所述的冻干剂，所述金属离子与海藻糖的摩尔比选自1：25～1：180，优选1：35～1：180，更优选自1：25、1：29.2、1：30、1：31、1：32、1：33、1：34、1：35、1：36、1：37、1：38、1：39、1：40、1：41、1：42、1：43、1：43.8、1：44、1：45、1：50、1：55、1：56、1：57、1：58、1：58.4、1：59、1：60、1：65、1：70、1：75、1：80、1：81、1：82、1：83、1：84、1：85、1：86、1：87、1：87.6、1：88、1：89、1：90、1：91、1：92、1：93、1：94、1：95、1：100、1：105、1：110、1：115、1：120、1：125、1：130、1：135、1：140、1：145、1：150、1：155、1：160、1：165、1：170、1：171、1：172、1：1...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯速，时鹏，单友田，钟丽敏，唐伟，郁云兰，杨徐磊，张永进，刘阳，
申请(专利权)人：南京诺唯赞生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。