【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及人工基因应用，具体涉及一种石蒜nbs基因及其提高石蒜中加兰他敏含量的方法。
技术介绍
1、石蒜属植物是原产中国的特色观赏和药用花卉，迄今为止，从石蒜科植物中分离出超过600种结构各异的生物碱类化合物，植物化学研究表明这类化合物具有多种药理学功能，药用价值极高。例如水仙环素具有抗肿瘤的活性；石蒜碱可以阻断细胞周期，诱发癌细胞系hl-60的细胞凋亡；网球花胺具有抗癌活性等。其中加兰他敏(gal)是一种石蒜科植物特有的异喹啉生物碱，作为乙酰胆碱酯酶抑制剂，可影响大脑尼古丁受体以及抑制乙酰胆碱酯酶活性，是治疗阿尔茨海默症(alzheimer’s disease,ad,老年痴呆症早期症状)的首选药物之一，该药已在欧美和中国主要市场批准上市。
2、包括加兰他敏在内的许多植物次生代谢产物在植物中的含量较低且资源有限，这极大的限制了这类具有极高药用价值的植物天然产物的商业化应用。例如加兰他敏在夏雪片莲中的含量仅为0.05-0.17％左右，利用hplc方法在石蒜鳞茎中测定的含量约在0.30-5.15mg/g，且不同种间和不同地理来源的含量差异较大；水仙环素在中国水仙、夏雪片莲和雪花莲中的含量约为10-65mg/kg，显然这些产量远不能满足商业化的需求。尽管早在1962年barton等研究者就首次人工合成了加兰他敏，但由于其中手性碳的存在，合成条件严苛、步骤复杂、产率低、消旋产物不易拆分等因素的存在，化学合成的制备成本甚至高于从植物中直接提取。至今，化学家们还在寻找可用于工业化生产的更加简便、经济的合成方法，而野生的石蒜资
技术实现思路
1、针对现有技术中的上述问题，本专利技术提供一种石蒜nbs基因，发现其具有提高石蒜中加兰他敏含量的功能，从而解决了现有技术加兰他敏在植物中的含量较低且资源有限的问题。
2、本专利技术采用的技术方案如下：
3、一种石蒜nbs基因，所述nbs基因序列如seq id no:1所示。
4、seq id no:1：atgaagggaagtctctcccatgagttggaagttgccttgcccgcggatgaactgtggcaagtctacggcac gctccgattggccgaactcgtcgtcgagctgctgcccactgtcatctccaaggtcgatgttgaggaaggtgatggcggggtcggcacggttcttcgcgtcacttttgccccaggcattccaggtataaaatatcacaaagagaaatttgtgaagattgatcatgaaaaacgcttgaaggacaccatcgtcgtagagggagggcacttagatctcagtttcagctcctacttaattcgcttcgaaatattggagaagggcaataattcttcaatcgttaagtcaactgtagagtatgaagttgatgaagaacatgcagcaaatgcttcctttgctacaactgacccattggtgatcattggagaagttgtttccaaacatctcttggagaaataa。
5、一种提高石蒜中加兰他敏含量的方法，包括如下步骤：
6、(1)将nbs基因构建入克隆载体得到pbwa(v)hs-nbs-glosgfp重组质粒，所得pbwa(v)hs-nbs-glosgfp重组质粒的基因序列如seq id no:2所示；
7、(2)将重组质粒带入农杆菌中得到转化农杆菌；
8、(3)将石蒜属愈伤组织放入含有转化农杆菌的无糖ms液体培养基中，侵染30min；
9、(4)将侵染后的石蒜属愈伤组织取出，无菌滤纸吸干愈伤组织表面的侵染液，接种于共培养的培养基上，进行暗培养；
10、(5)暗培养结束后，将其所得愈伤组织接种于含有抗生素的培养基平板上，继续进行暗培养，每隔20d继代一次，待愈伤组织分化后，则开始进行光照培养，直至分化出丛生芽；
11、(6)分化出丛生芽后将其转接到壮芽培养基上,进行壮芽培养；
12、(7)壮芽培养30d后再次转接到生根培养基，即得到提高加兰他敏含量的石蒜植株。
13、作为优选地，步骤(4)中，所述共培养的培养基配方为：蔗糖30g/l+琼脂7.5g/l+ms+3.0mg/l 6-ba+1.5mg/lnaa+100μmas，ph为5.8。
14、其中，构建后重组质粒后，seq id no:1的最后三个碱基会被切除，使得载体能顺利表达后面的荧光信号，最终seq id no:2:tagaatagca tcggtaacat gagcaaagtctgccgcctta caacggctct cccgctgacg ccgtcccgga ctgatgggct gcctgtatcg agtggtgattttgtgccgag ctgccggtcggggagctgtt ggctggctgg tggcaggata tattgtggtg taaacaaattgacgcttaga caacttaata acacattgcg gacgtttttaatgttagact gaattaacgc cgaattaattcgggggatct ggattttagt actggatttt ggttttagga attagaaatt ttattgatagaagtattttacaaatacaaa tacatactaa gggtttctta tatgctcaac acatgagcga aaccctatag gaaccctaattcccttatctgggaactact cacacattat tatggagaaa ctcgagcttg tcgatcgaca gatccggtcggcatctactc tatttctttg ccctcggacgagtgctgggg cgtcggtttc cactatcggc gagtacttctacacagccat cggtccagac ggccgcgctt ctgcgggcgatttgtgtacg cccgacagtc ccggctccggatcggacgat tgcgtcgcat cgaccctgcg cccaagctgc atcatcgaaattgccgtcaa ccaagctctgatagagttgg tcaagaccaa tgcggagcat atacgcccgg agtcgtggcg atcctgcaagctccggatgcctccgctcga agtagcgcgt 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种石蒜NBS基因，其特征在于，所述NBS基因序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种提高石蒜中加兰他敏含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.如权利要求2所述的提高石蒜中加兰他敏含量的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述共培养的培养基配方为：蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+MS+3.0mg/L 6-BA+1.5mg/L NAA+100μmAS，pH为5.8。
4.如权利要求3所述的提高石蒜中加兰他敏含量的方法，其特征在于，步骤(4)暗培养时间为3d，培养温度25±1℃。
5.如权利要求2所述的提高石蒜中加兰他敏含量的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述含有抗生素的培养基的配方为：蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+MS+6.0mg/L 6-BA+1.5mg/LNAA+25mg/L Kana+100mg/L头孢。
6.如权利要求5所述的提高石蒜中加兰他敏含量的方法，其特征在于，步骤(5)的暗培养的培养温度25±1℃；步骤(5)的光照培养光照强度100～300μmol·m-2·s-1，每天光照时间为16h。p>
7.如权利要求2所述的提高石蒜中加兰他敏含量的方法，其特征在于，步骤(6)中，所述壮芽培养基的配方为：蔗糖40g/L+琼脂7.5g/L+MS+3.0mg/L 6-BA+0.5mg/LNAA。
8.如权利要求7所述的提高石蒜中加兰他敏含量的方法，其特征在于，步骤(6)的壮芽培养的培养温度为25±1℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，每天光照时间为16h。
9.如权利要求2所述的提高石蒜中加兰他敏含量的方法，其特征在于，步骤(7)中，所述生根培养基的配方为：蔗糖40g/L+琼脂7.5g/L+MS+2.0mg/LIBA。
10.如权利要求9所述的提高石蒜中加兰他敏含量的方法，其特征在于，步骤(7)中，生根培养的培养温度为25±1℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，每天光照时间为16h。
...【技术特征摘要】
1.一种石蒜nbs基因，其特征在于，所述nbs基因序列如seq id no:1所示。
2.一种提高石蒜中加兰他敏含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.如权利要求2所述的提高石蒜中加兰他敏含量的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述共培养的培养基配方为：蔗糖30g/l+琼脂7.5g/l+ms+3.0mg/l 6-ba+1.5mg/l naa+100μmas，ph为5.8。
4.如权利要求3所述的提高石蒜中加兰他敏含量的方法，其特征在于，步骤(4)暗培养时间为3d，培养温度25±1℃。
5.如权利要求2所述的提高石蒜中加兰他敏含量的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述含有抗生素的培养基的配方为：蔗糖30g/l+琼脂7.5g/l+ms+6.0mg/l 6-ba+1.5mg/lnaa+25mg/l kana+100mg/l头孢。
6.如权利要求5所述的提高石蒜中加兰他敏含量的方法，其特征在于，步骤(5)的暗培养的...
【专利技术属性】
技术研发人员：李青竹，蔡友铭，张永春，杨柳燕，许俊旭，孙翊，杨贞，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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