【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种产肌酸的重组大肠杆菌及其构建方法，属于代谢工程和基因工程。
技术介绍
1、肌酸(creatine，cr)化学名称为n-甲基胍乙酸，又称为胍基醋酸、肌氨基酸等，是脊椎动物体内自然产生的一种氨基酸衍生物，在人体中95％的肌酸存在于骨骼肌中。cr在细胞能量稳态中起重要作用，被认为是一种能量缓冲剂；因具有改善机体能量代谢、促进肌细胞发育、抗氧化等生物学功能，已被应用于食品、医药等领域。目前，cr主要通过化学合成方法获得，合成cr的路线都存在反应时间长、操作过程复杂、产品纯度不高等问题，且化学合成法生产的cr一般都有苦味，不能直接作为食品添加剂使用，而后处理工艺复杂，且收获率只有50％，故通过微生物法异源表达cr具有重要意义。而大肠杆菌(escherichia coli)在工业上应用十分广泛，在生产蛋白和高附加值化合物的生产上具有非常重要的地位。此外，大肠杆菌因研究历史悠久、遗传背景清晰、基因编辑系统成熟、适用性广泛等，成为了一种优秀的工业模式微生物。故大肠杆菌被认为是生产cr的合适宿主。
2、全细胞转化法是通过代谢工程改造技术构建细胞工厂，以微生物细胞整体作为催化剂，催化底物转化为目标产物的过程。与传统的酶催化法相比，全细胞转化法具有一定的优势：(1)该方法省去了复杂的细胞裂解与酶纯化工艺，具有简单、容易操作的特点；(2)利用微生物细胞内的多酶体系，可以最大程度降低反应过程中级联催化的不足，提高酶的催化效率；(3)胞内酶受到完整的细胞体的保护，相比于游离酶更加稳定，因此催化反应的过程更加稳定和高效。全细胞转
3、目前，人们对于微生物法合成cr及其中间产物胍基乙酸(guanidinoacetate，gaa)进行了许多研究。如fan wenchao公开通过非致病性微生物例如谷氨酸棒状杆菌的发酵制备肌酸的方法(cn106065411 a)。该微生物具有以下生物转化功能：将葡萄糖转化为l-谷氨酸；l-谷氨酸至n-乙酰基-l-谷氨酸的转化；n-乙酰基-l-谷氨酸至n-乙酰基-l-谷氨酸半醛的转化；n-乙酰基-l-谷氨酸半醛至n-乙酰基-l-鸟氨酸的转化；n-乙酰基-l-鸟氨酸至l-鸟氨酸的转化；l-鸟氨酸至l-瓜氨酸的转化；l-瓜氨酸至精氨基-琥珀酸的转化；精氨基-琥珀酸至l-精氨酸的转化；l-精氨酸至胍基乙酸的转化；和最后地，胍基乙酸至肌酸的转化。如yiwen zhang等(yiwen zhang,et al.acs synthetic biology,2020)首次实现在重组大肠杆菌中设计了一个重组的鸟氨酸循环，通过引入异源精氨酸：甘氨酸氨基转移酶(agat)，设计了一个高效的全细胞催化剂用于生产gaa。
4、近年来，有关生物酶催化转化的研究也越来越多，但大多都是以精氨酸和甘氨酸为底物酶法催化合成gaa，以精氨酸、甘氨酸和蛋氨酸为底物酶法催化合成cr的研究较少，而cr的功能应用不可忽视。同时基于双酶共表达的极不平衡，因此以精氨酸、甘氨酸和蛋氨酸为底物通过酶法两步合成cr的研究势在必行。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术通过筛选4种不同来源胍基乙酸n-甲基转移酶gamt以及三种双酶共表达策略，并使用不同类型(柔性、刚性、可剪切)的融合linker，来融合cr生物合成途径中关键基因agat和gamt，最终实现了一种基因重组大肠杆菌全细胞转化高效生产肌酸的方法，所述方法是通过l(pkvspeavkkeael)融合表达甘氨酸脒基转移酶和胍基乙酸n-甲基转移酶构建重组菌作为发酵菌株，将精氨酸、甘氨酸和蛋氨酸作为底物发酵生产肌酸，最终实现融合蛋白稳定性与生物活性的改变而提高cr的产量。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种全细胞转化生产肌酸的方法，所述的方法为，以甘氨酸、精氨酸和活性蛋氨酸为底物，采用含有重组大肠杆菌的体系进行发酵生产，
3、所述重组大肠杆菌融合表达了甘氨酸脒基转移酶和胍基乙酸n-甲基转移酶，所述的融合表达为，采用单启动子启动甘氨酸脒基转移酶基因和胍基乙酸n-甲基转移酶基因的表达，且甘氨酸脒基转移酶基因和胍基乙酸n-甲基转移酶基因通过氨基酸序列如seq idno.11或seq id no.13所示的连接肽连接。
4、进一步地，所述甘氨酸脒基转移酶的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述胍基乙酸n-甲基转移酶的氨基酸序列如seq id no.3、seq id no.5、seq id no.7或seq id no.9所示。
5、进一步地，所述甘氨酸脒基转移酶基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述胍基乙酸n-甲基转移酶基因的核苷酸序列如seq id no.4、seq id no.6、seq id no.8或seqid no.10所示。
6、进一步地，在单启动子下游插入核苷酸序列如seq id no.15所示的rbs调控甘氨酸脒基转移酶基因和胍基乙酸n-甲基转移酶基因的表达。
7、进一步地，以pet系列质粒为表达载体。
8、进一步地，以e.coli bl21(de3)为宿主菌。
9、进一步地，所述单启动子为t7启动子。
10、进一步地，反应体系中，精氨酸、精氨酸或活性蛋氨酸的浓度为5 -25g/l。
11、进一步地，所述重组大肠杆菌在反应体系中的od600为40±2，在ph7.0-8.0的条件下反应。
12、进一步地，反应体系中含有9～15g/l胰蛋白胨，21～27g/l酵母粉，10～18g/l三水合磷酸氢二钾，2～5g/l磷酸二氢钾，1～5ml/l甘油。
13、进一步地，在25～40℃条件下反应24～48h。在本专利技术实施例中，在30℃条件下反应48h。
14、本专利技术的第二个目的是提供一种重组质粒，所述重组质粒上连接有单启动子、甘氨酸脒基转移酶基因、胍基乙酸n-甲基转移酶基因，以及用于连接甘氨酸脒基转移酶基因和胍基乙酸n-甲基转移酶基因的连接肽，所述连接肽的氨基酸序列如seq id no.11或seqid no.13所示。
15、进一步地，在所述单启动子和编码基因之间插入核苷酸序列如seq id no.15所示的rbs序列。
16、本专利技术的第三个目的是提供一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌含有所述重组质粒。
17、本专利技术的第四个目的是提供所述重组质粒或重组大肠杆菌在制备肌酸或含肌酸的产品中的应用。
18、本专利技术的有益效果：
19、本专利技术提供了一种全细胞转化生产肌酸的方法，通过融合表达策略的筛选，发现一种单启动子配合特定的连接肽融合表达双酶(来源于amycolatopsis kentuckyensis的甘氨酸脒基转移酶agat和来源于mus caroli的胍基乙酸n-甲基转移酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种全细胞转化生产肌酸的方法，其特征在于，所述的方法为，以甘氨酸、精氨酸和活性蛋氨酸为底物，采用含有重组大肠杆菌的体系进行发酵生产，
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甘氨酸脒基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述胍基乙酸N-甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.9所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在单启动子下游插入核苷酸序列如SEQ IDNO.15所示的RBS调控甘氨酸脒基转移酶基因和胍基乙酸N-甲基转移酶基因的表达。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单启动子为T7启动子。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系中，精氨酸、精氨酸或活性蛋氨酸的浓度为5-25g/L，重组大肠杆菌的OD600为40±2。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应条件为：25-40℃，200-240rpm，pH7.0-8.0。
7.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒上连接
8.根据权利要求7所述的重组质粒，其特征在于，在所述单启动子和编码基因之间插入核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的RBS序列。
9.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌含有权利要求7或8所述的重组质粒。
10.权利要求7或8所述的所述重组质粒或权利要求9所述的重组大肠杆菌在制备肌酸或含肌酸的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种全细胞转化生产肌酸的方法，其特征在于，所述的方法为，以甘氨酸、精氨酸和活性蛋氨酸为底物，采用含有重组大肠杆菌的体系进行发酵生产，
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甘氨酸脒基转移酶的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述胍基乙酸n-甲基转移酶的氨基酸序列如seq id no.3、seq idno.5、seq id no.7或seq id no.9所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在单启动子下游插入核苷酸序列如seq idno.15所示的rbs调控甘氨酸脒基转移酶基因和胍基乙酸n-甲基转移酶基因的表达。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单启动子为t7启动子。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系中，精氨酸、精氨酸或活性蛋氨酸的浓度为5-25g/l，重组大肠杆菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘延峰，刘潇，盛宇华，陈坚，刘龙，吕雪芹，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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