一种M-MLV逆转录酶的酶活测定组合物及测定方法技术

本发明专利技术公开了一种M

【技术实现步骤摘要】
一种M
‑
MLV逆转录酶的酶活测定组合物及测定方法


[0001]本专利技术涉及RNA逆转录酶
，具体为一种M
‑
MLV逆转录酶的酶活测定组合物及其测定方法。

技术介绍

[0002]莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurineleukeminvirus)逆转录酶(简称M
‑
MLV RTase)逆转录酶这个酶已经作了遗传性上的改变，即除去了与它联在一起的核糖核酸酶H活性(一种专门切割DNA与RNA杂交链上RNA分子的酶)。这个酶应用于cDNA的第一链合成和引物的延伸。这种酶需要镁离子或锰离子作为辅助因子，当以mRNA为模板时，先合成单链DNA(ssDNA)，再在逆转录酶和DNA聚合酶Ⅰ作用下，以单链DNA为模板合成“发夹”型的双链DNA(dsDNA)，再由核酸酶S1切成二条单链的双链DNA。因此，逆转录酶可用来把任何基因的mRNA逆转录成cDNA拷贝，然后可大量扩增插入载体后的cDNA。也可用来标记cDNA作为放射性的分子探针。
[0003]逆转录酶(M
‑
MLV)从MoloneyMurineLeukemiaVirus分离出来，可用于合成第一链 cDNA、制作cDNA探针、RNA转录、测序和RNA的逆转录反应。本酶是通过点突变使 RNaseH活性缺失，所以它具有的DNA聚合酶的活性与野生型相同，同时其延伸能力也有显著提高。
[0004]现有酶活测定方法缺点：误差大(需要用肉眼比较，人为因素大)，耗时长，成本高 (商品酶和待测酶用量大)，需要先做PCR扩增才能跑胶，容易造成气溶胶污染。

技术实现思路

[0005]基于上述情况，我们公开了一种M
‑
MLV逆转录酶的酶活测定方法，解决上述技术问题。
[0006]我们采用荧光定量的方法进行M
‑
MLV逆转录酶活测定，在37℃条件下等温延伸。 SYBR染料结合cDNA链发出荧光，Oligreen染料与单链结合发出荧光，比较SYBR染料和Oligreen染料这两种方法，选择出最高效最稳定、灵敏度高的酶活测定方法。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：
[0008]一种M
‑
MLV逆转录酶的酶活测定组合物，包括：RNA模板、Oligod(T)、逆转录缓冲液、dNTP、超纯水、荧光染料、RNase抑制剂、MMLV存储缓冲液和甘油；
[0009]所述逆转录缓冲液由如下成分组成：
[0010]50mM Tris
‑
HCl,pH8.375mM KCl10mM MgCl20.4mg/ml BSA0.2％CA
630
1％海藻糖0.2Mm TCEP
7.5％甘油4mM精氨酸4mM谷氨酸
[0011]所述MMLV存储缓冲液组成成分如下：
[0012]试剂终浓度Tris
‑
HCl(pH7.6)50mMNaCl150mMDTT1.0mMEDTA0.1mM甘油50％Triton X
‑
1000.10％去RNA酶水 [0013]所述RNA模板序列如SEQ ID NO.1所示；
[0014]所述Oligod(T)序列如SEQ ID NO.2所示。
[0015]优选的，荧光染料为：SYBR green；
[0016]所述测定组合物的具体组分为：
[0017]样品终浓度超纯水/逆转录缓冲液1
×
SYBR green0.4
×
dNTP0.50mM eachOligo dT0.20uMRNase抑制剂0.16U/ulRNA模板25ng/ul甘油每24份中含1.7份75％甘油
[0018]优选的，荧光染料为：Oligreen，所述测定组合物的具体组分如下。
[0019]样品终浓度超纯水/逆转录缓冲液1
×
Oligreen1
×
dNTP0.50mM eachOligo dT0.20uMRNase抑制剂0.16U/ulRNA模板25ng/ul甘油每24份中含1.7份75％甘油
[0020]优选的，
[0021]根据标准酶使用量x及其荧光信号值y，建立标准曲线y＝kx+b，得到荧光信号值与酶量的关系，相同反应条件下获得待测酶的荧光信号值y1，所述待测酶的酶活S1＝(y1‑
b)/
k，所述y1需在y值范围内。
[0022]优选的，具体包括以下步骤：
[0023](1)将DNA标准品稀释不同梯度且用染料预染5min；
[0024](2)待测酶与RNA模板在体系中延伸反应，延伸结束后，产物95℃放置30min，使 cDNA链裂解；
[0025](3)加入user酶水解引物、加入RNAse水解RNA；
[0026](4)然后在体系中加入Oligreen染料，将DNA标准品及处理好的体系放入仪器测得荧光信号；
[0027](5)根据DNA标准品建立标准曲线，得到荧光信号与DNA量的关系，计算得到待测酶酶活。
[0028]优选的，所述步骤(2)中延伸反应的条件为：(42℃，1分钟)20分钟；
[0029]优选的，所述步骤(5)中的计算公式为：
[0030]S2＝[((y3‑
b1)/k1)/(2*324.5)
‑
0.003)]*D/1.77；
[0031]式中，S2为待测酶的酶活力，单位为U/ml，k1为所述DNA标准品建立标准曲线的斜率，b1为所述DNA标准品建立标准曲线的截距，y3为待测酶得到的荧光信号差值，2为计算新生DNA为双链所以需乘以2，324.5为dNTP的相对平均分子质量，D为待测酶的稀释倍数。
[0032]本专利技术的技术原理如下：
[0033]SYBR染料结合cDNA链发出荧光，Oligreen染料与单链结合发出荧光。
[0034]SYBR Green是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。
[0035]Oligreen是一种只特异性结合单链核酸的染料，不与双链核酸结合。
[0036]与现有技术相比，本专利技术所达到的有益效果是：
[0037]1、提供一种检测逆转录酶酶活的方法，使逆转录酶酶活测定操作简单，耗时短；
[0038]2、SYBR染料法操作简单，耗时短；
[0039]3、Oligreen染料方法可以做到绝对定量，使酶活测定重复性很好。
附图说明
[0040]附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种M
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MLV逆转录酶的酶活测定组合物，其特征在于，包括：RNA模板、Oligod(T)、逆转录缓冲液、dNTP、超纯水、荧光染料、RNase抑制剂、MMLV存储缓冲液和甘油；所述逆转录缓冲液由如下成分组成：50mM Tris
‑
HCl,pH8.375mM KCl10mM MgCl20.4mg/ml BSA0.2％CA
630
1％海藻糖0.2Mm TCEP7.5％甘油4mM精氨酸4mM谷氨酸所述MMLV存储缓冲液组成成分如下：试剂终浓度Tris
‑
HCl(pH7.6)50mMNaCl150mMDTT1.0mMEDTA0.1mM甘油50％Triton X
‑
1000.10％去RNA酶水所述RNA模板序列如SEQ ID NO.1所示；所述Oligod(T)序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的一种M
‑
MLV逆转录酶的酶活测定组合物，其特征在于，所述荧光染料为：SYBR green；所述测定组合物的具体组分为。所述测定组合物的具体组分为。
3.根据权利要求1所述的一种M
‑
MLV逆转录酶的酶活测定组合物，其特征在于，荧光染料为：Oligreen，所述测定组合物的具体组分如下。样品终浓度超纯水/逆转录缓冲液1
×
Oligreen1
×
dNTP0.50mM eachOligo dT0.20uMRNase抑制剂0.16U/ulRNA模板25ng/ul甘油每24份中含1.7份75％甘油4.根据权利要求2所述的一...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵春艳，张惠丹，
申请(专利权)人：苏州绘真医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：