一种检测血液外泌体miRNA的引物组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术的目的在于提供一种检测血液外泌体miRNA的引物组、试剂盒及方法，采用微滴式数字PCR技术检测miRNA，在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，以荧光的有或无判定是否含有待检靶分子，且不需要内参基因即可直接计算初始模板的拷贝数，具有高灵敏度、高准确性、高效率的技术优势。

A primer set, kit and method for detecting miRNA in exosomes

【技术实现步骤摘要】
一种检测血液外泌体miRNA的引物组、试剂盒及方法
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种检测血液外泌体miRNA的引物组、试剂盒及方法。
技术介绍
随着大量对外泌体(exosomes)生物来源、其物质构成及运输、细胞间信号的传导以及在体液中的分布的研究发现外泌体具有多种多样的功能。外泌体的功能取决于其所来源的细胞类型，其可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等方方面面。有研究表明肿瘤来源的外泌体参与到肿瘤细胞与基底细胞的遗传信息的交换，从而导致大量新生血管的生成，促进了肿瘤的生长与侵袭。外泌体被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发，都导致研究界对外泌体的研究兴趣日益增长。外泌体内的miRNAs可在血液中稳定存在，目前检测miRNA的方法主要有Northern印迹分析，微点阵分析，定量实时PCR。Northern印迹分析需要的样本量大，涉及大量人工操作不适用于大规模的筛选实验，实验的重复性较弱，耗时长、通量低。微点阵需要的RNA初始样本量较大，且无法清楚的区分序列差异很小的miRNA。定量实时PCR检测灵敏度虽有提高但仍不能满足实际需求，且由于缺少内参基因没法做绝对定量来得到初始拷贝数。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测血液外泌体miRNA的引物组、试剂盒及方法，具有高灵敏度、高准确性、高效率的技术优势。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供了一种检测血液外泌体miRNA的引物组，包括以下引物对：引物对2上游引物：GATGCCATCAGAGACCCAGT，下游引物：TGATCCAAAGAAAATGTGCAA；优选地，所述引物组还包括以下探针：探针1，序列：AGAACATGTTTCCAGGTAGCCTGAA；探针2，序列：TACACTGGCTACTGAGCCATTGAGG；探针3，序列：AGACTGATGTTGACTGTTGAATCTC；探针4，序列：AGTCACTAGGGCACCATTTTGAAAC；探针5，序列：AACATACCTGTGACCTATGGAATTG。优选地，所述miRNA包括：miR-221，序列：AAATCTACATTGTATGCCAGGT；miR-222，序列：AGGATCTACACTGGCTACTGAG；miR-21，序列：TAGCTTATCAGACTGATGTTGA；miR-224，序列：CTAAACGGAACCACTAGTGACTTGAAAGCCC；miR-192，序列：GGCTGTCAATTCATAGGTCAG。本专利技术还提供了一种检测血液外泌体miRNA的试剂盒，包含上述引物组。本专利技术又提供了一种检测血液外泌体miRNA的方法，包括：1)提取待检测血液的外泌体miRNA；2)配制miRNA的扩增反应体系；3)生成反应液滴，将扩增反应体系包裹于液滴内；4)按照反应程序使待检核酸片段在液滴内进行扩增；5)使用液滴分析仪分析检测结果。优选地，所述扩增反应体系采用以下引物组：探针1：AGAACATGTTTCCAGGTAGCCTGAA；探针2：TACACTGGCTACTGAGCCATTGAGG；探针3：AGACTGATGTTGACTGTTGAATCTC；探针4：AGTCACTAGGGCACCATTTTGAAAC；探针5：AACATACCTGTGACCTATGGAATTG。优选地，步骤2)中，每25μL的扩增反应体系包括：优选地，步骤3)中，扩增反应体系与微滴生成油的体积比为1：1.0-2.0。优选地，步骤4)中，所述反应程序为：95℃，5min；95℃，30min，60℃，30min40循环；72℃，10min；4℃保持。本申请采用微滴式数字PCR技术检测miRNA，在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个或数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，以荧光的有或无判定是否含有待检靶分子，且不需要内参基因即可直接计算初始模板的拷贝数。本专利技术的有益效果如下：1、使用的样本为血液外泌体，实现无创检测；2、反应场所的微滴化大大降低了对初始样本量的需求，10pg模板即可检出，检测灵敏度高；3、不依赖Cq值或内参基因，可以直接读取靶分子的拷贝数，实现高准确度；4、操作步骤少、耗时短，且提高了一次性检测的通量、大大缩短检测周期。附图说明图1是本专利技术实施例肝癌患者血液外泌体miRNA的检测结果图。具体实施方式下面将结合附图通过具体实施例对本专利技术做进一步说明，应当理解的是，以下实施例并不构成对本专利技术保护范围的限定。任何在本专利技术的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。实施例一、相关miRNA及其序列miR-221：AAATCTACATTGTATGCCAGGT；miR-222：AGGATCTACACTGGCTACTGAG；miR-21：TAGCTTATCAGACTGATGTTGA；miR-224：CTAAACGGAACCACTAGTGACTTGAAAGCCC；miR-192：GGCTGTCAATTCATAGGTCAG。二、检测引物及探针序列三、实验步骤：1、经患者同意(均已签署知情同意书)，从合作医院处获得肝癌患者的血液样本。2、提取血液外泌体miRNA1)血液外泌体提取采用全式金外泌体提取试剂盒A、拿到新鲜的血液样品，吸取100μl，4℃，3000g离心15分钟去除样品中残留的细胞和碎片。B、加入25μlEPS混匀，4℃静置30分钟，10000g离心10分钟。C、弃上清收集沉淀，再次4℃，3000g离心30分钟，小心弃去上清。D、加入50μlERS溶液，用移液器轻轻吹打重悬沉淀，即得到外泌体。E、取1管EMB微球，4000g离心3分钟，弃上清，保留微球，加入1mlERS溶液混匀。F、4000g离心3分钟，小心弃上清，保留微球。G、将获得的外泌体溶液加入到微球中，4℃轻柔混匀2小时。H、4℃，4000g离心3分钟，小心吸取上清到新的离心管，即为纯化后的外泌体。2)外泌体miRNA的提取采用德国凯杰RNA提取试剂盒。A、先在外泌体中加入1mlQIAzol，室温放5min裂解。B、在QIAzol液中加入200μl氯仿剧烈震荡，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测血液外泌体miRNA的引物组，包括以下引物对：/n引物对1：

【技术特征摘要】
1.一种检测血液外泌体miRNA的引物组，包括以下引物对：
引物对1：
引物对2
引物对3
引物对4
引物对5


2.根据权利要求1所述的一种检测血液外泌体miRNA的引物组，其特征在于，所述引物组还包括以下探针：
探针1，序列：AGAACATGTTTCCAGGTAGCCTGAA；
探针2，序列：TACACTGGCTACTGAGCCATTGAGG；
探针3，序列：AGACTGATGTTGACTGTTGAATCTC；
探针4，序列：AGTCACTAGGGCACCATTTTGAAAC；
探针5，序列：AACATACCTGTGACCTATGGAATTG。


3.根据权利要求1所述的一种检测血液外泌体miRNA的引物组，其特征在于，所述miRNA包括：
miR-221，序列：AAATCTACATTGTATGCCAGGT；
miR-222，序列：AGGATCTACACTGGCTACTGAG；
miR-21，序列：TAGCTTATCAGACTGATGTTGA；
miR-224，序列：CTAAACGGAACCACTAGTGACTTGAAAGCCC；
miR-192，序列：GGCTGTCAATTCATAGGTCAG。


4.一种检测血液外泌体miRNA的试剂盒，包含权利要求1-3任意一项所述的一种检测血液外泌体miRNA的引物组。


5.一种检测血液外泌体miRNA的方法，包括：
1)提取待...

【专利技术属性】
技术研发人员：张惠丹，戴敬，赵春艳，赵洪玉，
申请(专利权)人：苏州绘真医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32