一种基于Arrl 1基因调控坐骨神经损伤后轴突再生及功能恢复的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于Arrl 1基因调控坐骨神经损伤后轴突再生及功能恢复的方法，本发明专利技术提供一种长链非编码RNA，Arrl 1及其下游的miRNA‑761和靶基因Cdkn2b作为治疗周围神经损伤修复的靶点。本发明专利技术中的长链非编码RNA，Arrl 1可以作为分子海绵的作用，特异性吸附miRNA‑761，从而抑制miRNA‑761的功能，进而促进靶基因Cdkn2b的表达调控神经轴突的再生及功能的恢复。

A method of regulating axon regeneration and functional recovery after sciatic nerve injury based on Arrl 1 gene

【技术实现步骤摘要】
一种基于Arrl1基因调控坐骨神经损伤后轴突再生及功能恢复的方法
本专利技术涉及基因
，具体为一种基于Arrl1基因调控坐骨神经损伤后轴突再生及功能恢复的方法。
技术介绍
目前对于坐骨神经损伤后的治疗手段主要局限于显微外科手术、局部外周神经的移植或组织工程材料的应用，但在长距离坐骨神经损伤或功能丧失严重的病人中无法取得好的疗效，主要是由于目前对于神经损伤修复中关键的调控分子靶点及调控的分子机制尚不完全阐明。神经再生及功能恢复的主要影响因素主要包括内源性的神经再生能力的调控及再生微环境的建立，本专利技术方案是基于Arrl1基因调控神经元胞体内源性的神经再生的能力，通过干扰Arrl1的表达从而促进坐骨神经轴突再生及功能的恢复。通过注射AAV病毒实现了背根神经节L4-L5中DRG内Arrl1的抑制，从而促进神经轴突的再生及感觉功能的恢复,取得了较好的效果。本专利技术目前的主要在大鼠坐骨神经损伤的动物模型中建立，后期将进一步在大动物及非人灵长类动物中进一步研究其治疗效果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于Arrl1基因调控坐骨神经损伤后轴突再生及功能恢复的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种基于Arrl1基因调控坐骨神经损伤后轴突再生及功能恢复的方法，包括以下步骤：A、考察Arrl1的表达及定位；B、干扰Arrl1的表达对神经元轴突生长的影响；C、Arrl1通过调节miR-761影响靶基因Cdkn2b的表达；D、Arrl1通过调节miR-761调节神经元轴突的生长。优选的，所述步骤A包括如下过程：a、DRG样本RNA提取及qRT-PCR：制备大鼠坐骨神经夹伤模型后，取术后0h,3h,9h,1d,4d,7d坐骨神经夹伤侧的L4-L6背根神经节(DRG)组织，通过TRIZOL进行组织RNA的提取：将不同时间点的L4、L5DRG组织用RNase-free吸头从冻存管中转移至1.5mlRNase-freeEP管中；向管中加入1mlTrizol裂解液，使用匀浆器将组织打成单细胞悬液后置于冰上；加入200μl三氯甲烷，手动剧烈振荡15s，室温静置至分层明显后12000rpm离心15min；小心取出离心管，吸取上清至新EP管中，再加入异丙醇800μl，上下轻柔颠倒混匀，于-20℃静置30min后12000rpm离心10min；弃去上清，用1ml75％乙醇将RNA沉淀清洗一遍，7500rpm离心5min；弃去上清，静置待剩余酒精挥发；用DEPC水或者RNase-free水溶解RNA，置于65℃水浴中促溶5min；测定并记录RNA的浓度与OD值，做好标记储存在-80℃中；RNA逆转录合成cDNA：使用TakaraRR047A逆转录试剂盒消化基因组DNA，将1μgRNA逆转成cDNA；b、Arrl1的核质定位的检测：使用PARISTMKit等份分离提取细胞核RNA及细胞质RNA：观察到DRG神经元生长状态良好后，用PBS润洗细胞去除代谢废物；依据细胞数目加入相应体积的CellFractionBuffer，用枪吹打30s左右，置于冰上裂解3min；转速500g离心5min，轻轻吸取上清转移至新的1.5mlRNase-freeEP管中并标记为细胞质组分，沉淀标记细胞核组分，并置于冰上；在细胞核组分中加入与CellFractionBuffer等体积的CellDisruptionBuffer，吹打30s左右后于冰上裂解15min，裂解过程中每3min剧烈震荡15s，使核组分能够完全裂解；在核质两种组分中分别加入等体积的2×Lysis/BindingBuffer，轻柔上下颠倒混匀，再加入与CellFractionBuffer等体积的无水乙醇并混匀；将混合液加入专用吸附柱中，转速12000g离心1min。待全部混合液过完吸附柱后，加入700μl洗涤液1，转速12000g离心1min；加入500μl洗涤液2/3，转速12000g离心1min；再重复洗一次后空甩30s；最后加入50μl洗脱液(提前95-100℃预热，洗脱一次；再加50μl洗脱，共收集100μl洗脱液；将两份RNA溶液使用RNeasyMiniKit分别进行RNA纯化，再用相同体积的RNase-freewater洗脱下两份RNA，做好标记后，再用Nanodrop测浓度；使用TakaraRR047A逆转录试剂盒，将等体积细胞核RNA和细胞质RNA分别逆转为cDNA，再通过qRT-PCR检测U6、Arrl1、β-actin在胞质与胞核中的相对分布。4.优选的，所述步骤B包括如下过程：a、分离培养DRG神经元：准备解剖液放入小皿中，加入双抗后置于冰上预冷。腹腔麻醉3只大鼠，用手术剪从尾部沿脊椎向头部剪开皮肤，小心剔出整根脊柱，从颈部开始打开椎板，用显微镊拽出所有DRG组织放入解剖液中；取出全部DRG组织后弃去解剖液，用细胞级别PBS淋洗组织2遍，洗去多余组织和血迹。弃去PBS，加入2ml胶原酶，将组织及消化液转移至5ml离心管中；用显微剪充分剪碎组织后放入细胞培养箱中，消化90min。离心弃去胶原酶，加入1ml胰酶消化液，用枪吹打1min左右至组织分散均匀，即可放进细胞培养箱消化10min，每5min拿出吹打均匀再放回培养箱；待组织消化至无明显组织块，即可向离心管中加入3ml消化终止液终止消化；用枪吹打1min左右即可过筛网，滤掉多余组织并收集细胞悬液至新的5ml离心管中，1100rpm×5min，弃去上清；向离心管中加入4ml提前预热的BSA溶液，重悬细胞，9000rpm离心5min，小心吸弃漂浮的杂细胞。再重复一遍此步骤；加入提前预热的神经元培养基，吹打细胞均匀后接种到6孔板中，十字混匀细胞后放入5％CO2，37℃培养箱中；b、DRG神经元病毒感染：观察细胞贴壁情况良好后即可加入病毒，病毒感染量控制在2×104v.g./cell；病毒感染操作过程中，沾染病毒的吸头均要浸泡在84消毒液；首先弃去原培养基，用预热的PBS润洗细胞，加入半倍体积的病毒感染培养基，再加入相应滴度的病毒，病毒需在细胞接种24h内加入，否则影响病毒侵染效果；病毒加入24h内将感染培养基弃去，换成新鲜完全培养基；病毒感染96h后，观察到细胞表达GFP荧光较强时即可收取细胞；若后续有染色需要则待病毒感染至96h后，用0.025％的胰酶消化重悬细胞并重新接种至24孔培养板中。接种后12～18h内收取细胞；c、体外神经元轴突生长实验：染色前对细胞进行病毒预感染96h，观察病毒表达GFP荧光亮度较亮即可进行染色；弃去细胞培养基，加入预热后的1×PBS润洗细胞；弃去1×PBS，加入预冷的4％多聚甲醛，冰上固定20min；弃去甲醛后，用1×PBS润洗，室温洗3次，5min/次；清洗结束后弃去PBS，轻轻滴加封闭液，每孔200μl，室温静置40min；弃去封闭液，轻轻滴加用一抗稀释液稀释Anti-β-TublinⅢantibody，每孔200μl，4℃静置孵育过夜；弃去一抗，用1×PBS润本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于Arrl 1基因调控坐骨神经损伤后轴突再生及功能恢复的方法，其特征在于：包括以下步骤：/nA、考察Arrl 1的表达及定位；/nB、干扰Arrl 1的表达对神经元轴突生长的影响；/nC、Arrl 1通过调节miR-761影响靶基因Cdkn2b的表达；/nD、Arrl 1通过调节miR-761调节神经元轴突的生长。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于Arrl1基因调控坐骨神经损伤后轴突再生及功能恢复的方法，其特征在于：包括以下步骤：
A、考察Arrl1的表达及定位；
B、干扰Arrl1的表达对神经元轴突生长的影响；
C、Arrl1通过调节miR-761影响靶基因Cdkn2b的表达；
D、Arrl1通过调节miR-761调节神经元轴突的生长。


2.根据权利要求1所述的一种基于Arrl1基因调控坐骨神经损伤后轴突再生及功能恢复的方法，其特征在于：所述步骤A包括如下过程：
a、DRG样本RNA提取及qRT-PCR：制备大鼠坐骨神经夹伤模型后，取术后0h,3h,9h,1d,4d,7d坐骨神经夹伤侧的L4-L6背根神经节(DRG)组织，通过TRIZOL进行组织RNA的提取：将不同时间点的L4、L5DRG组织用RNase-free吸头从冻存管中转移至1.5mlRNase-freeEP管中；向管中加入1mlTrizol裂解液，使用匀浆器将组织打成单细胞悬液后置于冰上；加入200μl三氯甲烷，手动剧烈振荡15s，室温静置至分层明显后12000rpm离心15min；小心取出离心管，吸取上清至新EP管中，再加入异丙醇800μl，上下轻柔颠倒混匀，于-20℃静置30min后12000rpm离心10min；弃去上清，用1ml75％乙醇将RNA沉淀清洗一遍，7500rpm离心5min；弃去上清，静置待剩余酒精挥发；用DEPC水或者RNase-free水溶解RNA，置于65℃水浴中促溶5min；测定并记录RNA的浓度与OD值，做好标记储存在-80℃中；
RNA逆转录合成cDNA：使用TakaraRR047A逆转录试剂盒消化基因组DNA，将1μgRNA逆转成cDNA；
b、Arrl1的核质定位的检测：使用PARISTMKit等份分离提取细胞核RNA及细胞质RNA：观察到DRG神经元生长状态良好后，用PBS润洗细胞去除代谢废物；依据细胞数目加入相应体积的CellFractionBuffer，用枪吹打30s左右，置于冰上裂解3min；转速500g离心5min，轻轻吸取上清转移至新的1.5mlRNase-freeEP管中并标记为细胞质组分，沉淀标记细胞核组分，并置于冰上；在细胞核组分中加入与CellFractionBuffer等体积的CellDisruptionBuffer，吹打30s左右后于冰上裂解15min，裂解过程中每3min剧烈震荡15s，使核组分能够完全裂解；在核质两种组分中分别加入等体积的2×Lysis/BindingBuffer，轻柔上下颠倒混匀，再加入与CellFractionBuffer等体积的无水乙醇并混匀；将混合液加入专用吸附柱中，转速12000g离心1min。待全部混合液过完吸附柱后，加入700μl洗涤液1，转速12000g离心1min；加入500μl洗涤液2/3，转速12000g离心1min；再重复洗一次后空甩30s；最后加入50μl洗脱液(提前95-100℃预热，洗脱一次；再加50μl洗脱，共收集100μl洗脱液；将两份RNA溶液使用RNeasyMiniKit分别进行RNA纯化，再用相同体积的RNase-freewater洗脱下两份RNA，做好标记后，再用Nanodrop测浓度；
使用TakaraRR047A逆转录试剂盒，将等体积细胞核RNA和细胞质RNA分别逆转为cDNA，再通过qRT-PCR检测U6、Arrl1、β-actin在胞质与胞核中的相对分布。


3.根据权利要求1所述的一种基于Arrl1基因调控坐骨神经损伤后轴突再生及功能恢复的方法，其特征在于：所述步骤B包括如下过程：
a、分离培养DRG神经元：准备解剖液放入小皿中，加入双抗后置于冰上预冷。腹腔麻醉3只大鼠，用手术剪从尾部沿脊椎向头部剪开皮肤，小心剔出整根脊柱，从颈部开始打开椎板，用显微镊拽出所有DRG组织放入解剖液中；取出全部DRG组织后弃去解剖液，用细胞级别PBS淋洗组织2遍，洗去多余组织和血迹。弃去PBS，加入2ml胶原酶，将组织及消化液转移至5ml离心管中；用显微剪充分剪碎组织后放入细胞培养箱中，消化90min。离心弃去胶原酶，加入1ml胰酶消化液，用枪吹打1min左右至组织分散均匀，即可放进细胞培养箱消化10min，每5min拿出吹打均匀再放回培养箱；待组织消化至无明显组织块，即可向离心管中加入3ml消化终止液终止消化；用枪吹打1min左右即可过筛网，滤掉多余组织并收集细胞悬液至新的5ml离心管中，1100rpm×5min，弃去上清；向离心管中加入4ml提前...

【专利技术属性】
技术研发人员：于彬，王东，陈燕萍，刘明稳，顾晓松，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32