防御素及其在制备修复损伤神经药物中的应用制造技术

本发明专利技术利用小球藻表达了改造的兔防御素NP-1(mNP-1)，在小球藻中表达的防御素对神经损伤具有修复功能。本发明专利技术的结果可应用于制备修复神经损伤药物。

【技术实现步骤摘要】
防御素及其在制备修复损伤神经药物中的应用
本专利技术涉及防御素及其在制备修复损伤神经药物中的应用。具体地，涉及利用小球藻生产的防御素mNP-1，及其在制备修复损伤神经药物中的应用。
技术介绍
防御素的结构特点及分类防御素是一类广泛存在于动物、植物和人类体内具有微生物抗性的阳离子小肽。防御素一般由29-54个氨基酸组成，分子量为3-6KD。在结构上具有以下共同特点：(1)带正电荷，(2)富含精氨酸，(3)具有一定数目的保守的半胱氨酸，(4)通过半胱氨酸分子形成分子内二硫键，使肽环合形成反向平行的β片层结构。自1985年美国加里福尼亚大学Lehrer教授对其命名以来(Selstedetal.，1985)，受到国内外科学家的广泛关注。根据分子大小、结构与功能的差异，可将防御素大致分为四类：α防御素、β防御素、昆虫防御素与植物防御素。基于半胱氨酸残基的间距和二硫键的形式，哺乳动物的防御素可分为三类：α防御素、β防御素和θ防御素。哺乳动物的防御素由18-42个氨基酸组成，其中6个保守的半胱氨酸形成了3对二硫键，使肽链折叠成β片层结构。α防御素由29-36个氨基酸组成，二硫键的连接方式为1-6、2-4、3-5；β防御素由38-42个氨基酸组成，二硫键的连接方式为1-5、2-4、3-6，β防御素中还有一个脯氨酸和甘氨酸；1999年从非人灵长类恒河猴中发现了新的一类防御素——由18个氨基酸残基组成的环状θ防御素，它们是由两个不同的截短的α防御素类肽连接而成。防御素在人体中广泛分布，人体中α防御素有6种，其中4种即HNP1-4主要产生于粒细胞，2种HD5-6主要产生于潘氏细胞；人类基因组有28个β-防御素基因，在人类和鼠类已经鉴定出超过35个β-防御素基因。防御素的表达与病原体的入侵是紧密相关的，例如在透析病人的腹腔中同时发现有α防御素与β防御素，又如细菌性脑膜炎患儿的脑脊髓液中防御素的浓度比非细菌性脑膜炎高150倍。眼内防御素的表达研究表明，防御素在泪液中的含量与感染时的表达不同。研究表明防御素在人体防病抗病中起着非常重要的作用。到目前为止，分离到的兔防御素有9种，其中7种为α防御素：NP-1，NP-2，NP-3a，NP-3b，NP-4，NP-5和CorticostatinVI，产生于粒细胞。另外2个兔防御素：RK-1和RK-2，产生于兔肾细胞。兔防御素NP-1比人防御素HNP-1的抗菌活性强5～10倍，两者间的这一明显差异被归结为它们的分子净电荷性质：在NP-1分子中含有9个净正电荷，而在HNP-1分子中仅含有3个净正电荷。目前，从生物体中分离到的防御素已达30多种，其中兔防御素(NetrophilePeptide-1，NP-1)的抗性谱最广。兔防御素NP-1由33个氨基酸组成，属于α-防御素，有6个半胱氨酸，它们形成3个二硫键，连接位置分别为1-6，2-4，3-5(Ganz，1989)。它对梅毒螺旋体、很多革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和病毒有显著的抑制或毒杀效应。防御素除了直接的抗菌活性外，还具有免疫调节作用，防御素可选择性聚集单核细胞，T淋巴细胞，树突状细胞和肥大细胞趋化到炎症部位以促进适应性免疫(Territoetal.，1989；Chertovetal.，1996；Yangetal.，1999；Niyonsabaetal.，2002)。此外，防御素还能诱导腹腔肥大细胞释放组胺和提高巨噬细胞的吞噬作用(Befusetal.，1999；Fleischmannetal.，1985；Ichinoseetal.，1996)。抗炎症的特性已被归因于防御素，如抑制多核型白细胞甲酰肽受体介导的炎症和结合细菌内毒素(Grutkoskietal.，2003；Motzkusetal.，2006)。此外，防御素可诱导成纤维细胞和上皮细胞的增殖以促进伤口的修复(Murphyetal.，1993；Aarbiouetal.，2002，2004)。防御素抗微生物机理在动植物及人体内，防御素含量极其少，却执行着机体重要的防御功能。与传统抗生素相比，防御素有其独特的抑制机理。防御素的抗菌作用机理为：它依靠静电作用，通过本身所带的正电荷与带负电荷的微生物细胞膜相互吸附，即防御素与革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS)、革兰氏阳性菌的脂磷壁酸等阴离子分子作用而附着在靶细胞表面，二聚或多聚的防御素穿膜形成瞬时的或稳定的跨膜离子通道(兔防御素NP-1形成瞬时的，人防御素HNP-1形成稳定的跨膜离子通道)，导致细胞内溶液外渗，从而扰乱了细胞膜的通透性及细胞能量状态，导致细胞膜去极化，呼吸作用受到抑制以及细胞内ATP含量下降，最终导致靶细胞死亡。防御素的抗病毒作用则是通过与病毒外壳蛋白结合而导致病毒失去生物活性。正是由于这种特殊的作用机理，目的微生物难以产生抗防御素的抗性突变，因此防御素被认为是一种新型低耐药性甚至无耐药性的抗感染肽类。神经系统分类神经系统可分为：中枢神经系统和外周神经系统。外周神经系统可分为：转入神经系统和传出神经系统。按机能分神经可分为：(1)运动神经(motornerve)，也称传出神经(efferentnerve)，为传出性神经，由运动神经纤维(也叫传出神经纤维)组成。又可分为躯体运动神经与内脏运动神经两种：躯体运动神经为支配骨骼肌的传出神经，大多数由粗的有髓鞘神经纤维组成。内脏运动神经即植物性神经。(vegetativenerve)，为支配平滑肌、心肌和腺体的传出神经。多为薄髓鞘或无髓鞘的细神经纤维。(2)感觉神经(sensorynerve)也称传入神经(afferentnerve)，为传入性神经，由感觉神经纤维组成。又可分为躯体感觉神经与内脏感觉神经两种。它们来自脑神经节和脊神经节内的假单极细胞的外周突，其纤维粗细不一，可以是有髓纤维、薄髓纤维或无髓纤维。其神经末梢分布到皮肤、肌肉、关节或脏器内的感受器。按与中枢的联系分：脑神经(12对)和脊神经(31对)。按有无髓鞘包裹分：有髓鞘神经和无髓鞘神经。防御素对神经作用的机制人防御素HNP-1和兔防御素NP-1对传入神经纤维具有降低脉冲频率的作用，该作用效果具有浓度依赖性，浓度范围：0.0001-1nM。神经递质L-谷氨酸的兴奋作用相当程度上受兔防御素NP-1抑制。这些发现暗示防御素的作用机制可能涉及突触传递的改变，且由神经递质L-谷氨酸介导(Andrianovetal.，2007)。兔防御素NP-1与感觉神经元的相互作用可能通过神经元细胞膜上的特异性受体，5-羟色胺受体可能参与了该过程。兔防御素NP-1与感觉神经元细胞膜相互作用的机制可能是通过防御素中第十四位酸性氨基酸Glu(谷氨酸)的羧基与膜受体形成氢键作用(PLakhovaetal.，2000)。β-防御素对神经的保护功能可能是通过阻碍细胞凋亡，增加细胞增殖和促进中枢神经系统创伤愈合(Williamsetal.，2012)。有证据表明，体外实验中，β-防御素可以减缓凋亡机制的发生，人中性粒细胞中的β-防御素HBD-3可通过趋化因子受体CCR6来减少细胞凋亡(Nagaokaetal.，2008)。兔防御素NP-1影响豚鼠十二指肠初级传入神经元动作电位的产生，并极大地降低十二指肠初级传入神经元对5-羟色胺和组胺作用的敏本文档来自技高网...

【技术保护点】
氨基酸序列为SEQ ID NO：16所示的短肽mNP‑1或编码所述短肽mNP‑1的核酸在制备修复神经类药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.氨基酸序列为SEQIDNO：16所示的短肽mNP-1或编码所述短肽mNP-1的核酸在制备修复神经类药物中的应用，其中所述神经是周围神经。2.权利要求1所述的应用，其中所述核酸的序列为SEQIDNO：15所示的序列。3.权利要求1所述的应用，其中所述药物为溶液、片剂、胶囊、雾剂、膏剂、...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡赞民，徐海林，陈宇红，白丽莉，徐春归，范成明，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，北京大学人民医院，
类型：发明
国别省市：北京;11