一种制备多肽药物的方法技术

本发明专利技术涉及一种制备多肽药物DiaPep277的方法，包含：将Fmoc-Asp(OtBu)-OH与树脂P偶联，得到Fmoc-Asp(OtBu)-P；将Fmoc-Asp(OtBu)-P采用逐一偶联的方式固相合成，得到DiaPep277-P；将DiaPep277-P裂解，得到DiaPep277粗肽。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种制备多肽药物的方法，具体而言，涉及DiaPep277的制备方法。
技术介绍
DiaPep277是源自人热休克蛋白60(HSP60)序列上的一段含24个氨基酸的肽段。DiaPep277的结构如下：H-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Val-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp-OH。研究证明，DiaPep277能够调节免疫系统，使胰岛细胞免受破坏并保护胰岛素分泌功能。因此，DiaPep277为自身免疫性糖尿病患者的治疗带来实质性的突破，并且可以作为这种糖尿病发病高危人群的预防性用药。这种药物可以明显提高I型糖尿病患者的生存质量，延缓或阻止各种并发症的发生，以提高患者的预期寿命。
技术实现思路
对于含有24个氨基酸的短肽，由于固相方法存在操作简便，溶剂使用量小，易于自动化等优点，因此往往采用常规的保护氨基酸进行固相顺序偶联进行合成。但是，经分析DiaPep277的肽链后，本专利技术人发现，该肽链存在一些特殊的情况，大量的疏水性基团(特别是N端)及-Gly-Gly-Gly-结构的存在会使合成存在较大的困难。如果采用常规的Fmoc-Gly-OH原料容易在合成-Gly-Gly-Gly-结构时产生±Gly的杂质等。本专利技术的目的在于采用特殊的氨基酸原料来解决上述困难，提高粗肽的纯度与收率。本专利技术提供一种制备多肽药物DiaPep277的方法，包含以下步骤：1)以一种树脂P作为载体，将Fmoc-Asp(OtBu)-OH与树脂偶联，得到Fmoc-Asp(OtBu)-P；2)以Fmoc-Asp(OtBu)-P为原料，采用逐一偶联的方式与其他氨基酸原料进行固相合成，得到DiaPep277-P；3)将DiaPep277-P裂解，得到DiaPep277粗肽；其中Fmoc为9-芴甲氧羰基，与氨基相连或与羧基所连的碳原子上的氮原子相连，其中步骤2)所述的逐一偶联的方式中Asp-Ser结构采用的合成原料是Fmoc-Asp(OtBu)-Ser(ψMe，MePro)-OH，其为一个假脯氨酸二肽，使丝氨酸被保护成五元环，结构如下：其中-Gly-Gly-Gly-结构采用的合成原料为Fmoc-(Hmb)Gly-OH、Fmoc-(Dmb)Gly-OH、Fmoc-Gly-(Dmb)Gly-OH或Fmoc-Gly-(Hmb)Gly-OH中的一种或两种。优选地，本专利技术方法还包括纯化DiaPep277的步骤。具体实施方式对本专利技术中所用缩写及其含义说明如下：本文中，“替代度”指的是单位量的树脂负载的物质的数量，单位为“mmol/g”。本文中，如无相反说明，则所述反应在常温常压下进行。本专利技术中的宽泛的、优选的、更优选的、和最优选的定义和范围可以相互组合。本专利技术中“肽”是指类似地通过多肽合成中的Fmoc固相合成方法得到的偶联产物。对所述载体树脂无特别限定，只要其具有可与物质中的羧基进行反应的活性位点且不与所述物质中的其他基团反应即可。所述载体树脂优选为2-CTC树脂或王树脂两类，树脂替代度为0.2-1.0mmol／g，优选为0.3-0.8mmol／g，更优选为0.4-0.6mmol／g。本专利技术所用王树脂类的结构如下：所用2-CTC树脂类的结构如下：其中代表树脂结构的其余部分且该部分不参与反应。上述两种树脂均可商购得到(天津南开和成科技有限公司)或按文献已知的方法制备。在一个具体实施方案中，可根据树脂的用量、反应前的替代度以及所需的反应后的替代度来选择Fmoc-氨基酸-OH的用量，通常为树脂上可与氨基酸偶联的官能团的摩尔数的1-5当量，优选2-4当量，更优选2.5-3.5当量，其中树脂上可与氨基酸偶联的官能团摩尔数为树脂重量与替代度的乘积。所述溶剂为，例如，但不限于，DMF、DCM、DMSO、NMP、THF、乙酸乙酯、甲醇、乙醚等及其任意混合物，优选DMF、DCM，或DMF和DCM的混合液(例如，二者体积比为1：1)。偶联制备肽树脂可采用多肽合成领域中技术人员已知的Fmoc固相合成方法来实现，例如可以参见文献Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach，W.C.Chan，Peter D.White著，March2，2000(ISBN-10：0199637245)，英国Oxford University Press。偶联中对树脂的洗涤和溶胀可采用实现该目的的任何试剂进行，优选DMF。所述偶联在固相反应柱中进行。对固相反应柱无特别限制，可为可实现此目的的任意固相反应柱。优选地，将步骤1)-2)中物质中的羧基进行活化，活化优选在冰水浴中进行。活化剂优选为DIPEA或DIC。其中在氨基酸Fmoc-Asp(OtBu)-OH偶联至载体树脂上之后，还包括向其中加入一种封闭液除去树脂中过量的未反应基团的步骤，以避免其在下一步偶联反应中与另外的待偶联物质反应形成副产物，以及除去所加入的封闭液的步骤。当所述载体树脂为2-CTC树脂时，所加入的封闭液优选为甲醇；当所述载体树脂为王树脂时，所加入的封闭液优选为摩尔比为1：1的乙酸酐和吡啶。偶联优选在偶联剂的存在下进行，所述偶联剂优选为DIC、A或其结合，或者为DIPEA、A、B或其结合，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU和TBTU中的一种；例如，步骤1)中的偶联剂为HOBt／DIC。步骤2)所述的Fmoc-Asp(OtBu)-Ser(ψMe,Mepro)-OH的偶联体系为HATU／HOAt／DIPEA、PyBOP／HOBt／DIPEA或TBTU／HOBt／DIPEA中的一种。步骤2)所述的逐一偶联的方式中-Gly-Gly-Gly-结构采用的合成原料为Fmoc-(Hmb)Gly-OH、Fmoc-(Dmb)Gly-OH、Fmoc-Gly-(Dmb)Gly-OH或Fmoc-Gly-(Hmb)Gly-OH中的一种或两种；优选地，所述原料为选自Fmoc-(Hmb)Gly-OH和Fmoc-(Dmb)Gly-OH的一种，以及选自Fmoc-Gly-(Dmb)Gly-OH和Fmoc-Gly-(Hmb)Gly-OH的一种。步骤2)所述的Gly合成原料的偶联体系为DIC／H本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备多肽药物DiaPep277的方法，包含以下步骤：1)以一种树脂P作为载体，将Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH与树脂偶联，得到Fmoc‑Asp(OtBu)‑P；2)以Fmoc‑Asp(OtBu)‑P为原料，采用逐一偶联的方式与其他氨基酸原料进行固相合成，得到DiaPep277‑P；3)将DiaPep277‑P裂解，得到DiaPep277粗肽；其中Fmoc为9‑芴甲氧羰基，与氨基相连或与羧基所连的碳原子上的氮原子相连，其中步骤2)所述的逐一偶联的方式中Asp‑Ser结构采用的合成原料是Fmoc‑Asp(OtBu)‑Ser(ψMe，Mepro)‑OH，其为一个假脯氨酸二肽，使丝氨酸被保护成五元环，结构如下：其中‑Gly‑Gly‑Gly‑结构采用的合成原料为Fmoc‑(Hmb)Gly‑OH、Fmoc‑(Dmb)Gly‑OH、Fmoc‑Gly‑(Dmb)Gly‑OH或Fmoc‑Gly‑(Hmb)Gly‑OH中的一种或两种。

【技术特征摘要】
1.一种制备多肽药物DiaPep277的方法，包含以下步骤：
1)以一种树脂P作为载体，将Fmoc-Asp(OtBu)-OH与树脂偶联，
得到Fmoc-Asp(OtBu)-P；
2)以Fmoc-Asp(OtBu)-P为原料，采用逐一偶联的方式与其他氨
基酸原料进行固相合成，得到DiaPep277-P；
3)将DiaPep277-P裂解，得到DiaPep277粗肽；
其中Fmoc为9-芴甲氧羰基，与氨基相连或与羧基所连的碳原子上的
氮原子相连，
其中步骤2)所述的逐一偶联的方式中Asp-Ser结构采用的合成原
料是Fmoc-Asp(OtBu)-Ser(ψMe，Mepro)-OH，其为一个假脯氨酸二肽，
使丝氨酸被保护成五元环，结构如下：
其中-Gly-Gly-Gly-结构采用的合成原料为Fmoc-(Hmb)Gly-OH、
Fmoc-(Dmb)Gly-OH、Fmoc-Gly-(Dmb)Gly-OH或
Fmoc-Gly-(Hmb)Gly-OH中的一种或两种。
2.权利要求1的方法，还包括纯化DiaPep277的步骤，纯化优选通
过重结晶方法或HPLC(例如反相HPLC)而进行。
3.权利要求1的方法，其中步骤1)-3)均在室温和常压下进行；步
骤1)-2)的偶联反应在固相反应柱中进行。
4.权利要求1的方法，其中所述树脂P为2-CTC树脂或王树脂；
其中所述树脂P的替代度为0.2-1.0mmol／g，优选为0.3-0.8mmol／g，
更优选为0.4-0.6mmol／g。
5.权利要求1的方法，其中步骤2)所述的逐一偶联的方式中
-Gly-Gly-Gly-结构采用的合成原料为选自Fmoc-(Hmb)Gly-OH和
Fmoc-...

【专利技术属性】
技术研发人员：宓鹏程，潘俊锋，马亚平，袁建成，
申请(专利权)人：深圳翰宇药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44